German Title: Integrative Multiomdynamiken der humanen Adipozytendifferenzierung mit dem Focus auf DNA Hydroxymethylierung und epigenomischen Effekte der Lanzeitbehandlung mit Docosahexaensäure

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Abstract

Metabolic Syndrome is a multifactorial metabolic disorder characterized by obesity in association with altered lipid profiles, elevated glucose levels, and/or increased blood pressure, forming a cluster of risk factors for cardiovascular diseases and type 2 diabetes. Changes in lifestyle and diet are powerful strategies in preventing the development of the metabolic syndrome. An evolving research field linked with preventable diseases is the consumption of bioactive-enriched foods since for some bioactives the dose for healthpromoting effects can only be achieved by enrichment. Docosahexaenoic acid (DHA) is an n-3 fatty acid displaying lipid-lowering activity. In the liver, DHA inhibits lipogenesis thereby promoting an improved lipid profile in the blood. However, the impact of DHA on preadipocytes, the source for new adipocytes generated during adipogenesis for additional lipid storage, remains insufficiently characterized. Cell differentiation processes are controlled by epigenetic mechanisms including DNA hydroxymethylation and are associated with cell-type specific transcriptional regulation. To profile epigenetic gene regulation of our model system, I first characterized human adipocyte differentiation of Simpson-Golabi-Behmel Syndrome (SGBS) cells at the level of DNA hydroxymethylation (5hmC) using two whole-genome sequencing techniques. I observed gain in the 5hmC mark during adipocyte differentiation, particularly enriched at enhancer regions, around adipogenic transcription factor (TF) binding sites. Based on cluster analyses, I was able to describe clusters with different dynamics of hydroxymethylation associated with the binding of specific TFs. Early hydroxymethylation clusters were enriched with TF binding motifs involved, e.g., in clonal expansion at an early stage of adipogenesis. On the other hand, hydroxymethylation emerging during late adipogenesis was associated with TF binding in the second phase of chromatin remodeling, such as of the peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARG) and of CCAAT/enhancer binding protein alpha (CEBPA). Integrated analysis of hydroxymethylation and gene expression recapitulated the involvement of hydroxymethylated enhancer regions in the regulation of gene expression programs characteristic of mature adipocytes. By maintaining mature adipocytes in culture for 14 days after completion of adipocyte differentiation, I could provide evidence for 5hmC as a stable epigenetic mark. In vivo relevance of these findings was confirmed by a high degree of overlap with hydroxymethylation in white adipose tissue (WAT). As 5hmC is often considered as an intermediated mark generated during DNA demethylation, I investigated potential mechanisms involved in 5hmC stabilization. I detected that acetylated nei like DNA glycosylase 1 (acNEIL1), reported previously as a hydroxymethylation binding protein, was enriched in WAT promoter and enhancer regions, but its binding was independent of the hydroxymethylation mark, especially in promoter regions. Based on metabolome data, I rather hypothesize that declining α-ketoglutarate (αKG) levels during adipogenesis could compromise ten-eleven translocation (TET)-mediated demethylation and thereby contribute to stabilization of the 5hmC mark in nonproliferating mature adipocytes. In the second part of my thesis, I investigated the effect of long-term cultivation (3 - 4 weeks) of SGBS in the presence of low-dose DHA on genome-wide DNA methylation (EPIC array) and gene expression levels (RNA-seq). DHA-treatment resulted in massive methylation differences. However, these methylation differences mainly overlapped with gradual cultureassociated methylation changes. A subset of the differentially methylated CpGs was located in partially methylated domains (PMDs) associated with the nuclear lamina and characterized by late replication timing. These sites displayed gradual loss in methylation, correlating with a methylation-based mitotic score (EpiCMIT.hypo) and attributed to an impairment of DNA methylation maintenance during replication. At the gene expression level, I could separate effects directly attributable to DHA from culture-associated gene expression changes. Notably, I detected anti-inflammatory activity by reduction of tumor necrosis factor alpha (TNFα) signaling and repression of sterol regulatory element-binding protein 1/2 (SREBP1/2) signaling, possibly contributing to reduced lipogenesis and increased insulin sensitivity – two crucial mechanisms in the prevention of the metabolic syndrome. To sum up, molecular understanding of the interplay of cellular metabolism and epigenetics in gene regulation of human adipocyte differentiation might be crucial for the deeper understanding of the development of metabolic syndrome – a disease with altered energy metabolism. Furthermore, deciphering the molecular mechanisms of DHA in human preadipocytes might help to understand how to reverse some of the adverse effects of obesity and its associated metabolic complications, showing us a path towards improved public health.

Translation of abstract (German)

Das metabolische Syndrom ist eine multifaktorielle Stoffwechselstörung, die durch Fettleibigkeit in Verbindung mit veränderten Lipidprofilen, erhöhten Glukosespiegeln und/oder erhöhtem Blutdruck gekennzeichnet ist und ein Cluster von Risikofaktoren für Herz-KreislaufErkrankungen und Typ-2-Diabetes bildet. Änderungen des Lebensstils und der Ernährung sind wirksame Strategien, um die Entwicklung des metabolischen Syndroms zu verhindern. Ein sich entwickelnder Forschungsbereich im Zusammenhang mit vermeidbaren Krankheiten ist der Verzehr von mit Bioaktivstoffen angereicherten Lebensmittel, da bei einigen Bioaktivstoffen die Dosis für gesundheitsfördernde Wirkungen nur durch Anreicherung erreicht werden kann. Docosahexaensäure (DHA) ist eine n-3-Fettsäure mit lipidsenkender Wirkung. In der Leber hemmt DHA die Lipogenese, wodurch ein verbessertes Lipidprofil im Blut gefördert wird. Die Wirkung von DHA auf Präadipozyten, die sich während der Adipogenese zu neuen Adipozyten für zusätzliche Lipidspeicherung entwickeln können, ist jedoch noch unzureichend charakterisiert. Zelldifferenzierungsprozesse werden durch epigenetische einschließlich DNA-Hydroxymethylierung, um die Mechanismen gesteuert, zelltypspezifische Genexpression zu regulieren. Um die epigenetische Genregulation unseres Modellsystems zu profilieren, habe ich zunächst die humane Adipozytendifferenzierung von Simpson-Golabi-Behmel Syndrom (SGBS) Zellen auf der Ebene der DNA-Hydroxymethylierung (5hmC) unter Verwendung von zwei Sequenzierungstechniken, die das gesamte Genom abdecken, charakterisiert. Ich beobachtete eine Zunahme von 5hmC während der Adipozytendifferenzierung, besonders an Enhancer-Regionen um die Bindungsstellen der adipogenen Transkriptionsfaktoren (TF) herum. Basierend auf Clusteranalysen konnte ich Cluster mit unterschiedlichen Dynamiken der Hydroxymethylierung beschreiben, die mit der Bindung spezifischer TFs assoziiert waren. Frühe Hydroxymethylierungscluster waren mit TFBindungsmotiven angereichert, die z. B. an der klonalen Expansion im frühen Stadium der Adipogenese beteiligt sind. Andererseits war eine spätere Anreicherung der Hydroxymethylierung mit Bindung von TFs in der zweiten Phase des Chromatin-Umbaus assoziiert, wie z. B. des Peroxisom-Proliferator-aktivierten Rezeptor Gamma (PPARG) und von CCAAT/Enhancer-Binding-Protein Alpha (CEBPA). Die integrierte Analyse von Hydroxymethylierung hydroxymethylierten und Genexpression rekapitulierte die Beteiligung von Enhancer-Regionen an der Regulierung von Genexpressionsprogrammen, die für reife Adipozyten charakteristisch sind. Beispielsweise waren spät induzierte Hydroxymethylierungscluster um Gene lokalisiert, die am Lipidstoffwechsel beteiligt sind. Indem ich reife Adipozyten für 14 Tage nach Abschluss der Adipozytendifferenzierung in Kultur hielt, konnte ich Hinweise darauf geben, dass die beobachtete Hydroxymethylierung eine stabile epigenetische Modifizierung ist. Die in vivoRelevanz dieser Befunde wurde durch einen hohen Grad an Überlappung mit der Hydroxymethylierung im weißen Fettgewebe (WAT) bestätigt. Da 5hmC oft als Zwischenprodukt der DNA-Demethylierung angesehen wird, habe ich mögliche Mechanismen untersucht, die an der 5hmC-Stabilisierung beteiligt sein könnten. Ich fand heraus, dass acetylierte nei-ähnliche DNA-Glykosylase 1 (acNEIL1), die zuvor als Hydroxymethylierungsbindendes Protein beschrieben worden war, in WAT-Promotor- und Enhancer-Regionen angereichert war, aber die Bindung unabhängig von der Hydroxymethylierung war, insbesondere in Promotor-Regionen. Basierend auf Metabolomdaten stelle ich eher die Hypothese auf, dass sinkende α-Ketoglutarat (αKG)-Konzentrationen während der Adipogenese die Ten-Eleven-Translokation (TET)-vermittelte Demethylierung beeinträchtigen und somit zur Stabilisierung der 5hmC-Modifizierung in nicht proliferierenden reifen Adipozyten beitragen könnten. Im zweiten Teil meiner Arbeit untersuchte ich die Wirkung einer Langzeitkultivierung (3 - 4 Wochen) von SGBS Präadipozyten in Gegenwart von niedrig dosiertem DHA auf die genomweite DNA-Methylierung (EPIC-Array) und Genexpressionsniveaus (RNASequenzierung). DHA-behandelte Proben zeigten im Vergleich zu Kontrollproben massive Methylierungsunterschiede. Diese Methylierungsunterschiede überschnitten sich jedoch hauptsächlich mit graduellen Zellkultur-assoziierten Methylierungsänderungen. Ein Teil der differenziell methylierten CpGs befand sich in partiell methylierten Domänen (PMDs), die mit der Nuklearlamina assoziiert sind und durch ein spätes Replikationstiming gekennzeichnet sind. Diese Stellen zeigten einen allmählichen Methylierungsverlust, der mit einem methylierungsbasierten mitotischen Index (EpiCMIT.hypo) korreliert und auf eine Beeinträchtigung der DNA-Methylierung während der Replikation zurückzuführen ist. Auf der Ebene der Genexpression konnte ich Effekte, die direkt auf DHA zurückzuführen sind, von Zellkultur-assoziierten Veränderungen der Genexpression trennen. Ich beobachtete eine entzündungshemmende Aktivität durch die Verringerung der Signalübertragung des Tumornekrosefaktors alpha (TNFα) und die Unterdrückung der Signalübertragung des ‚Sterol regulatory element-binding protein 1/2' (SREBP1/2), was möglicherweise zu einer verringerten Lipogenese und einer erhöhten Insulinsensitivität beiträgt, zwei entscheidende Mechanismen zur Prävention des Metabolischen Syndroms. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das molekulare Verständnis des Zusammenspiels von Zellstoffwechsel und Epigenetik bei der Genregulation der Adipozytendifferenzierung entscheidend für das tiefere Verständnis der Entwicklung des metabolischen Syndroms ist,einer Krankheit mit verändertem Energiestoffwechsel. Darüber hinaus könnte die Aufklärung molekularer Mechanismen von DHA in menschlichen Präadipozyten helfen zu verstehen, wie einige der metabolischen Komplikationen, die mit Fettleibigkeit verbunden sind, rückgängig gemacht werden können, um uns einen Weg zu einer verbesserten Gesundheit der Bevölkerung aufzuzeigen.