English Title: Investigations on the in vivo depletion of regulatory T cells and their impact on the immunotherapy of the B16 melanoma

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Abstract

Natürlich vorkommende regulatorische T-Zellen (Treg) sind essentiell an der Suppression von Effektor T-Zellen (Teff) beteiligt und verhindern dadurch beispielsweise Autoimmunkrankheiten. Außerdem wurde wiederholt beschrieben, dass Treg Immunreaktionen gegen verschiedene Tumore behindern. Diese Eigenschaft wurde dadurch deutlich, dass in Tiermodellen die Depletion von Treg vor der Tumorinokulation zu vermindertem Wachstum der Tumore führte. In Melanom-Patienten ist diese präventive Behandlung nicht durchführbar, da der Tumor in diesen Fällen bereits etabliert ist. Aus diesem Grund sollte im murinen B16 Modell untersucht werden, ob es möglich ist existierende Melanome mittels einer Kombination aus Treg-Depletion und Te_-Stimulation zu behandeln. Eine Depletion der Treg mittels Injektion des mAk PC61 vor der Tumorinokulation bewirkte die schon beschriebene Verminderung des Tumorwachstums. Im Gegensatz dazu hatte die Treg-Depletion zu späteren Zeitpunkten während der Tumorentwicklung (fünf oder zehn Tage nach der Tumorinokulation) ein beschleunigtes Wachstum zur Folge. Die Kombination von Treg-Depletion und therapeutischer Vakzinierung mit Tumorantigen-beladenen dendritischen Zellen (DC) bewirkte sogar ein sehr stark beschleunigtes Tumorwachstum. Die präventive Anwendung von PC61 führte zu niedrigeren Anzahlen von tumorassoziierten Treg und gleichzeitig zu einem Anstig der CD4+ und CD8+ Zellen in den Tumoren. Im Gegensatz dazu konnte bei therapeutischer Treg-Depletion kein Unterschied in der Infiltration der Tumore zwischen behandelten und nicht behandelten tumortragenden Mäusen festgestellt werden. Da durch therapeutische Injektion von PC61 und DC das Tumorwachstum stark beschleunigt wurde, war anzunehmen, dass der mAk CD25+ Teff depletiert. Zur Überprüfung dieser Annahme wurden Mäusen CFSE-gefärbte OVA-spezifische TCR-transgene CD4+ Zellen injiziert. Den Mäusen wurden OVA-beladene DC und gleichzeitig PC61 appliziert. Überraschender Weise waren weder die Anzahl der re-isolierten transgenen Zellen noch ihre Fähigkeit zu proliferieren und IL-2 zu produzieren in PC61-behandelten Mäusen reduziert sondern im Gegenteil erhöht. Diese Daten zeigen, dass die Beschleunigung des Tumorwachstums durch therapeutische Anwendung der Treg-Depletion nicht auf einer Ko-Depletion von Teff beruht. Vielmehr scheint die Entwicklung einer Tumorabstoßung abhängig von der Infiltration der Tumore durch CD4+ und CD8+ Zellen zu sein. Nur eine präventive Treg-Depletion verändert das Infiltrationsmuster des Tumors dahingehend, dass weniger Treg dafür aber mehr CD4+ und CD8+ Zellen einwandern. In fortgeschrittenen Tumorstadien scheint der Tumor ein Millieu zu schaffen, durch dass er den übertritt von T-Zellen und auch mAk ins Tumorgewebe verhindert.

Translation of abstract (English)

Naturally occurring regulatory T cells (Treg) are essentially involved in the suppression of effector T cells (Teff) to prevent the onset of autoimmune diseases. Furthermore they have been described to impede immune responses against several tumors, thus depletion of Treg before tumor challenge results in diminished tumor growth in several animal models. However in melanoma-bearing patients this preventive treatment cannot be applied, as the tumor is already established. Therefore, investigations were done in the murine B16 model to find out if it is possible to treat existing melanomas combining the depletion of Treg with stimulation of effector T cells. Depletion of Treg by injection of the mAb PC61 before tumor-challenge resulted in decreased tumorgrowth as has been decribed by others. In contrast the depletion of Treg during tumor development (five or ten days after tumor-challenge) led to accelerated growth of the tumors. Combing Treg-depletion and therapeutic vaccination using tumorantigen-loaded dendritic cells (DC) resulted in an even much faster tumorgrowth. The preventive application of PC61 led to diminished numbers of tumorassociated Treg and at the same time to an increase of CD4+ and CD8+ cells in the tumors. In contrast, in the therapeutic setting no difference in the in_ltration of tumors occured between the Treg depleted mice and non-treated tumor-bearing mice. As the tumorgrowth was strongly enhanced after therapeutic injections of PC61 and DC, it could be assumed that the mAb depletes CD25+ Te_. To test this assumption, mice were injected with CFSE-labeled OVA-specific TCR-transgenic CD4+ cells. The mice were then injected with OVA-loaded DC and at the same time with PC61. Surprisingly, neither the amount of recovered transgenic cells nor their ability to proliferate and produce IL-2 was not diminished but rather enhanced in PC61-treated mice. These Data show that the acceleration of the tumorgrowth after therapeutical Treg-depletion is not due to a co-depletion of Te_. It seems that the development of a tumor rejection is dependent on the infiltration by CD4+ and CD8+ cells. The preventive Treg-depletion results in diminished infiltration by Treg and enhanced in_ltration of CD4 and CD8 cells. During later stages of tumor development the tumor seems to create a millieu that disables the diapedesis of T cells and mAb into the tumortissue.