German Title: Überlegenheit des Ohres als Ort für DNA Immunisation in Maus-Tumormodellen

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Abstract

DNA vaccination can induce antibodies, helper T cell responses, CTL responses, and protective immunity in various animal models for infectious diseases and cancers. However, naked DNA immunization is still inefficient in large animals and human. I demonstrate in this thesis: i) that the site of DNA vaccine application is important; ii) that a viral DNA sequence can augment anti-tumor effects; iii) that electroporation improves anti-tumor immunity; and iv) that dendritic cells are essential and sufficient for antigen presentation in ear pinna DNA immunization. Intra-ear pinna (ie) DNA injection led to earlier and stronger antigen expression compared to intradermal injection at the flank skin (id). The ie site was superior to the id site also with regard to induction of humoral and cellular immune responses. To improve the anti-tumor effect of the DNA vaccines, an immunostimulating sequence coding for hemagglutinin-neuraminidase (HN) of Newcastle disease virus (NDV) was introduced as an adjuvant. HN expression in cells was demonstrated to induce IFN-α production, lymphocyte binding activity as well as anti-tumor activity. By combining this adjuvant with ie TAA (tumor associated antigen) DNA immunization, prophylactic and therapeutic anti-tumor immunity was improved in mouse tumor models. The tumor lines expressed either a surrogate tumor antigen beta-galactosidase (β-gal), or a TAA, human epithelial cell adhesion molecule (EpCAM). Improvements of the anti-tumor activity might be due to the observed increase of Th1 responses, anti-tumor CTL activity and innate immune reactivity, as well as due to down-regulated suppressive factors such as TGF-β and level of myeloid derived suppressor cells (MDSCs). To further improve the ie DNA immunization strategy, it was combined with electroporation (EP). Such DNA EP led to clear-cut improvements of humoral and cellular immune responses when applied ie. The effects in the ear pinna were superior to id DNA EP. In both prophylactic (β-gal as a TAA) and therapeutic (human EpCAM as a TAA) tumor models, DNA EP was demonstrated to increase anti-tumor activity significantly compared to DNA immunization without EP. I was able to identify a short DC-specific CD11c promoter sequence of 700-bp. Upon introduction into the DNA vaccine, such vector was found to induce similar anti-tumor immunity as a DNA vector driven by the CMV promoter although the latter led to much stronger antigen expression. This observation suggests that DCs are sufficient for antigen presentation of ear pinna DNA immunization. Thus, DNA vaccines encoding xenogeneic TAAs were particularly effective when applied to the ear pinna and induced protective and therapeutic anti-tumor immunity in mouse tumor models. The combination with HN as an adjuvant or with electroporation further augmented the anti-tumor effects. Studies on the mechanisms revealed that DCs in the ear pinna are essential for the immunization effect.

Translation of abstract (German)

Ziel der Arbeit war es, herauszufinden wie man eine DNS Vakzine, die für ein Tumorantigen kodiert, so optimieren kann, dass sie in Maus Tumormodellen zu einer protektiven anti-Tumor Immunantwort führt. Es konnten mehrere wichtige Parameter herausgearbeitet werden, die für eine effektive Immunantwort entscheidend sind: 1. Die Injektionsstelle der Vakzine. Die Haut der Ohrmuschel stellte sich als optimal heraus und war anderen Injektionsorten überlegen. 2. Durch Einführung einer viralen Nukleotidsequence in den DNS Vektor ließ sich die Immunogenität der anti-tumoralen Vakzine weiter steigern. 3. Durch zusätzliche Elektroporation der Injektionsstelle ließ sich eine weitere Steigerung des Immunisierungseffektes erreichen. 4. Was den Mechanismus der Ohrmuschelhaut-Immunisierung betrifft, so konnte gezeigt werden, dass hierfür Dendritische Zellen entscheidend wichtig sind. Immunisierungen in der Ohrmuschel (ie) der Maus führten zu einer früheren und stärkeren Antigenexpression im Vergleich zur intradermalen (id) Inokulation in der Flanke. ie Immunisierungen führten im Vergleich zu id Immunisierungen auch zu einer stärkeren humoralen und zellulären spezifischen Immunantwort. Die virale Nukleotidsequence, die einen zusätzlichen Adjuvans Effekt ausübte kodierte für Hämagglutinin-Neuraminidase (HN) Protein des Newcastle-Disease Virus. HN Expression in transfizierten Zellen regte die Produktion von Interferon alpha in anderen Zellen an, und führte zu einer verbesserten Bindung von Lymphozyten. Durch Kombination von HN und Tumorantigen konnte bei ie Immunisierungen in Maus Tumormodellen sowohl in einem prophylaktischen wie auch in einem therapeutischen Immunisierungsprotokoll durch DNS Immunisierung protektive anti-Tumor Immunität erzeugt werden. Die transfizierten Tumorlinien exprimierten wie die DNS Vektoren entweder bakterielle ß-Galaktosidase als Surrogat Tumorantigen oder humanes EpCAM als natürliches Tumorantigen. Die optimierten Immunisierungsprotokolle führten zu erhöhten Th1 und zytotoxischen T Zell Antworten , sowie erhöhter natürlicher Immunität und verminderter suppressiver Faktoren with TGF-ß und Level von MDSC Zellen. Durch Elektroporation konnte der DNS Immunisierungseffekt ie weiter gesteigert werden. Das drückte sich auch in einer Verbesserung des anti-tumoralen Effektes aus. Es konnte gezeigt werden, dass selektive Expression des Vektor vermittelten Tumorantigens in Dendritischen Zellen (DZ) mit Hilfe eines DZ-spezifischen Promoters (CD11c, eine neue 700 Basenpaar Sequenz) ausreichend für den anti-Tumor Effekt war, obwohl der Gesamt-Antigen-Expressionslevel in der Ohrmuschel viel geringer war als bei Verwendung des CMV Promoters. Wurden DZ in CD11c-Diphtheria Toxin (DT) Rezeptor transgenen Mäusen durch Einsatz von DT eliminiert, so ließ sich ie keine anti-tumorale Immunität mehr erzeugen. DZ in der Ohrmuschel sind also essentiell und ausreichend für den DNS vermittelten Immunisierungseffekt.