German Title: Multiviewmikroskopie mit einem lichtscheibenbasierten Fluoreszenzmikroskop

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Abstract

The axial resolution of any standard single-lens light microscope is lower than its lateral resolution. The ratio is approximately 3-4 when high numerical aperture objective lenses are used (NA 1.2 -1.4) and more than 10 with low numerical apertures (NA 0.2 and below). In biological imaging, the axial resolution is normally insufficient to resolve subcellular phenomena. Furthermore, parts of the images of opaque specimens are often highly degraded or obscured. Multiple-view fluorescence microscopy overcomes both problems simultaneously by recording multiple images of the same specimen along different directions. The images are digitally fused into a single high-quality image. Multiple-view imaging was developed as an extension to the light-sheet based fluorescence microscope (LSFM), a novel technique that seems to be better suited for multiple-view imaging than any other fluorescence microscopy method to date. In this contribution, the LSFM properties, which are important for multiple-view imaging, are characterized and the implementation of LSFM based multiple-view microscopy is described. The important aspects of multiple-view image alignment and fusion are discussed, the published algorithms are reviewed and original solutions are proposed. The advantages and limitations of multiple-view imaging with LSFM are demonstrated using a number of specimens, which range in size from a single yeast cell to an adult fruit fly and to Medaka fish.

Translation of abstract (German)

Die axiale Auflösung jedes auf einem einzelnen Objektiv basierenden Lichtmikroskops ist schlechter als seine laterale Auflösung. Daher ist auch die Auflösung in einem konfokalen oder einem zweiphotonenabsorbierenden Fluoreszenzmikroskop entlang der optischen Achse schlechter als in der Fokalebene. Das Verhältnis der Auflösungen ist 3 bis 4 bei hohen numerischen Aperturen (NA 1,2 – 1,4) und kann für niedrige numerische Aperturen (NA < 0,2) sogar Werte von 10 bis 15 erreichen. Damit ist der Einsatz der konventionellen Lichtmikroskopie gerade für große Objekte eventuell sehr stark eingeschränkt. Die schlechte axiale Auflösung ist nicht ausreichend, um kleine Objekte innerhalb einer Zelle zu lokalisieren. Dazu kommt, dass große Objekte nicht komplett erfasst werden können. Die Beobachtung entlang mehrerer Raumrichtungen stellt sich dieser Aufgabe, indem sie Bildstapel desselben Objekts entlang verschiedener Winkel aufzeichnet. Diese unabhängig voneinander aufgezeichneten Bildstapel werden in einem nachfolgenden Prozess zu einem neuen Datensatz zusammengefasst. Die Datenaufzeichnung entlang unterschiedlicher Raumrichtungen wurde am EMBL im Rahmen der Fluoreszenz-Lichtscheibenmikroskopie entwickelt (LSFM). Das LSFM ist bislang das einzige bekannte Mikroskop, an dem ein solches Konzept zur Datenfusion erfolgreich demonstriert werden konnte. In dieser Arbeit werden die Aspekte eines LSFM, die für die Aufnahmen entlang unterschiedlicher Raumrichtungen wichtig sind, charakterisiert. Außerdem wird die Implementierung eines LSFM ausführlich beschrieben. Wesentliche Aspekte werden sorgfältig diskutiert und in den allgemeinen Kontext bereits publizierter Arbeiten gestellt. Die Bilderfassung unterschiedlicher Objekte (u.a. Medaka Fisch, Fruchtfliege, Bäckerhefe) illustriert zwar die Grenzen aber vor allem die Möglichkeiten.