German Title: Charakterisierung des Protein-Protein Interaktionsnetzwerkes innerhalb der Zentralen Domäne des S. cerevisiae Kinetochores

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Abstract

The kinetochore is a specialized structure composed of centromeric DNA and a large number of proteins. The primary function of the kinetochore is to connect chromosomes with the mitotic spindle throughout the cell cycle and to monitor the fidelity of these attachments in order to ensure proper chromosome segregation. Despite the fact that chromosome segregation is directed by the kinetochore, the architecture and assembly of such an intricate structure remains elusive. We use budding yeast as a model system to characterize direct interactions among the central domain of the kinetochore proteins, specifically the COMA-complex. The COMA-complex consists of four proteins; two nonessential proteins Ctf19 and Mcm21 and two essential proteins Ame1 and Okp1. Although the chromosome segregation is a highly conserved process, the human orthologues of the two essential Ame1 and Okp1 proteins have not been identified. The tetrameric complex is the core of the COMA-network which is composed of seven additional nonessential proteins: Ctf3, Mcm16, Mcm22, Chl4, Iml3, Nkp1 and Nkp2, more loosely associated. According to the central localization within the kinetochore, the COMA-complex represents one of the linker complexes (together with the Mtw1-, Ndc80- and Spc105-complexes) bridging the centromere-associate inner proteins with microtubule-bounded outer kinetochore proteins. Here we present a biochemical approach to reconstitute and to characterize the budding yeast COMA-network. Our first aim was to reconstitute the COMA-complex in vitro and in vivo. A stabile heterodimer consisting of Ctf19 and Mcm21 proteins could be reconstituted as a tetrameric complex in solution. The Ame1 and Okp1 heterodimer showed noticeable instability and we were not able to reconstitute it. Surprisingly, the trimeric Ctf19, Mcm21 and Okp1-complex could be assembled in vivo independently of the Ame1 essential protein. Moreover, we demonstrated that the Okp1 coiled-coil region per se is sufficient to form a complex with Ctf19 and Mcm21 proteins in vitro. The tetrameric COMA-complex could have also been reconstituted in vitro, but the amount and the stoichiometry of the components were not satisfactory. In solution, the COMA-complex showed oligomerization behavior. Through the protein purification experiments, we also found that the Ctf19, Mcm21 and Okp1-complex as well as the Ame1 protein separately may bind to unspecific, E.coli RNA. To determine other kinetochore subunits that can directly or indirectly associate with the COMA-components, we performed co-immunoprecipitation from yeast cells with either Okp1-TAP or Ame1-TAP tagged proteins. Among many known interacting partners, the Dsn1 component of the Mtw1-central kinetochore complex was identified. To support this finding and to test if the binding between the Dsn1 and the COMA-proteins is direct or indirect, we performed in vitro reticulocyte lysate binding assay. The interaction between the Mtw1- and the COMA-complexes via the Dsn1 protein was confirmed. Additional information has been gained from the co-immunoprecipitation experiments using budding yeast cells. We identified two proteins from the COMA-network, Nkp1 and Nkp2 proteins, as highly enriched. Since this may reflect the close proximity of these two proteins to the core of the COMA-network, we purified separately Nkp1 and Nkp2 dimer (which revealed the stabile heterodimer formation between these two Nkp proteins), combined it with the recombinant COMA-complex and reconstituted the hexameric protein complex at a 1:1:1:1:1:1 stoichiometry. Taken together, this study led to proposal of a new model for the spatial organization of the COMA-network. In summary, we used affinity based protein isolation to identify new direct binding partners within the central domain of the budding yeast kinetochore. Our findings improve the current understanding of the overall kinetochore architecture. The complete characterization of the kinetochore structure and organization has to be fully known, ultimately leading to three-dimensional vision and biochemical features of the kinetochore complexes, in order to unravel the mechanisms of chromosome segregation and maintenance of genome stability. Our work is therefore one step further in answering relevant biological and medical questions concerning faithful chromosome segregation during mitosis.

Translation of abstract (German)

Das Kinetochor stellt eine Struktur dar, die aus centromerer DNA und einer großen Zahl an Proteinen besteht. Während der Zellteilung ist die primäre Aufgabe des Kinetochores, die Chromosomen mit der Mitosespindel zu verbinden und die Korrektheit dieser Verbindung zu überprüfen. Auf diese Weise kommt dem Kinetochore eine zentrale Bedeutung bei der korrekten Verteilung der Chromosomen während der Mitose zu. Dennoch ist bisher wenig über dessen Architektur und Zusammensetzung bekannt. Zur Analyse der Interaktionen zwischen den einzelnen Komponenten des Kinetochores untereinander und insbesondere zur genaueren Charakterisierung des COMA Komplexes wurde der Modelorganismus S. cerevisiae verwendet. Der COMA Komplex besteht aus zwei nicht-essentiellen (Ctf19 und Mcm21) und zwei essentiellen (Ame1 und Okp1) Proteinen. Obwohl die Chromosomensegregation ein hochkonservierter Vorgang ist, wurden die orthologen Proteine von Ame1 und Okp1 im Menschen bisher nicht identifiziert. Der tetramere Komplex ist der Kern des COMA-Netzwerkes, das aus sieben weiteren nicht-essentiellen Proteinen besteht: Ctf3, Mcm16, Mcm22, Chl4, Iml3, Nkp1 und Nkp2, die weniger stark assoziiert sind. Aufgrund der zentralen Anordnung im Kinetochor stellt der COMA-Komplex (zusammen mit dem Mtw1-Komplex und dem Spc105-Komplex) einen der Linker-Komplexe dar, der die Proteine des Inneren und des äußeren Kinetochores verbindet. Mit Hilfe von biochemischen und zellbiologischen Methoden haben wir das Hefe COMA-Netzwerk rekonstituiert und charakterisiert. •In vitro und in vivo Rekonstitution des COMA-Komplexes. Ein stabiles Heterodimer bestehend aus den Proteinen Ctf19 und Mcm21 konnte als dimerer/tetramerer Komplex in vitro rekonstituiert werden. Das Heterodimer aus Ame1 und Okp1 zeigte beachtliche Instabilität, die eine Rekonstitution unmöglich machte. Dennoch konnte der trimere Komplex bestehend aus Ctf19, Mcm21 und Okp1 in vivo, unabhängig von dem essentiellen Protein Ame1, zusammengesetzt werden. Darüber hinaus konnten wir in vitro zeigen, dass die coiled coil Domäne von Okp1 alleine ausreichend für die Bildung eines Komplexes mit Ctf19 und Mcm21 ist. Der tetramere COMA-Komplex konnte ebenfalls in vitro rekonstituiert werden, allerdings waren sowohl die Menge als auch die Stöchiometrie der einzelnen Komponenten nicht zufriedenstellend. In Lösung neigte der COMA-Komplex zur Bildung von Oligomeren. Zudem zeigte die Proteinaufreinigung, dass sowohl Ctf19, Mcm21 und Okp1 als auch Ame1 alleine unspezifisch mit RNA zu interagieren scheinen. •Die zentrale coiled-coil Domäne von Okp1 ist notwendig für die Bildung des COMA-Komplexes und ist essentiell für das Überleben der Zelle. Durch verschiedene Deletionskonstrukte des Okp1 Proteins konnten wir die zentrale coiled-coil Domäne des Proteins als die essentielle Region für die Okp1 Funktion und damit für die Lebensfähigkeit der Zelle bestimmen. In vitro Untersuchungen mit diesen Okp1 Deletionskonstrukten identifizierte die coiled-coil Region als Interaktionsdomäne, die zur Bildung des trimeren Komplexes mit Mcm21 und Ctf19 wechselwirkt. •Mtw1- und dem COMA-Komplex interagieren vorwiegend über das Protein Dsn1. Um andere Kinetochor Untereinheiten zu bestimmen, die direkt oder indirekt mit dem COMA-Komplex assoziieren können, wurde mit Hilfe des Okp1-TAP Konstrukts eine Co-Immunopräzipitation aus Hefezellextrakt durchgeführt. Neben vielen bekannten Interaktionspartnern wurde Dsn1, eine Komponente des zentralen Kinetochor-Komplexes Mtw1, identifiziert. Um dieses Ergebnis zu unterstreichen und zu analysieren, ob Dsn1 direkt oder indirekt an die COMA Proteinen bindet, haben wir einen in vitro Reticulozyten Lysat-Assay durchgeführt. Dadurch konnte die Interaktion zwischen dem Mtw1- und des COMA-Komplexes über Dsn1 bestätigt werden. •Der COMA-Komplex scheint über die Proteine Mif2 und Cse4 mit centromerem Chromatin zu interagieren. Vorläufige Daten von in vitro Bindungsstudien legten nahe, dass Cse4 sowohl mit Ame1 als auch mit dem CMO-Komplex interagiert, wohingegen Mif2 nur mit dem CMO-Komplex und nicht mit Ame1 allein wechselwirkt. Dieses Ergebnis weist auf folgende räumliche Organisation der zentralen Kinetochorschicht hin: Mif2 und CMO sind sich näher als Mif2 und Ame1. •Die Proteine Nkp1 und Nkp2 stabilisieren direkt den COMA-Komplex. Ein hexamerer Komplex konnte mit einer Stöchiometrie von 1:1:1:1:1:1 rekonstituiert werden. Durch Co-Immunopräzipitationsexperimente mit Hefezellen wurden zwei Proteine – Nkp1 und Nkp2- des COMA-Netzwerkes identifiziert, die stark angereichert waren. Dies spiegelt möglicherweise die Nähe dieser beiden Proteine zum Kern des COMA-Netzwerkes wider. Nkp1 und Nkp2 wurden daraufhin getrennt als Dimere aufgereinigt (dies zeigt die Bildung eines stabilen Heterodimers der beiden Nkp- Proteine) und mit dem rekombinierten COMA-Komplex gemischt. Dabei konnte ein hexamerer Komplex mit einer Stöchiometrie von 1:1:1:1:1:1 rekonstituiert werden. In vitro Untersuchungen zeigten, dass der Nkp-Dimer vorwiegend über die Proteine Ame1 und Okp1 mit dem COMA-Komplex interagiert. Zusammenfassend kann man sagen, dass diese Erkenntnisse das derzeitige Verständnis des COMA-Netzwerkes und der allgemeinen Hefe Kinetochor Architektur verbessern.