German Title: Identifizierung und Charakterisierung der Protein Phosphatase 1, Catalytic Subunit Alpha (PP1alpha) als Regulator von NF-kappaB in T-Lymphozyten

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Abstract

Der Transkriptionsfaktor nuclear factor-kappa B (NF-kappaB) ist für die Aktivierung und das Überleben von T-Lymphozyten essentiell. NF-κB reguliert die Expression von Zytokinen, Wachstumsfaktoren und anti-apoptotischen Genen. Entsprechend ist die physiologische NF-kappaB-Aktivierung von zentraler Bedeutung für eine effiziente Immunantwort. Verschiedenste Neoplasien weisen Genmutationen auf, die zu einer aberranten, meist konstitutiven NF-kappaB-Aktivität führen. Diese erlaubt es Tumorzellen, den Zell-intrinsischen Kontrollmechanismen zu entgehen und unkontrolliert zu proliferieren. Die T-Zell Rezeptor (TZR)-induzierte Signalleitung, die zur Aktivierung von NF-kappaB führt, basiert größtenteils auf Phosphorylierungsreaktionen, die zu Veränderungen in der Funktion und Aktivität der phosphorylierten Proteine führen. Diese Phosphorylierung von Proteinen ist aber meist transient. Während viele Kinasen und ihre Substrate charakterisiert wurden, ist die Rolle von Phosphatasen in der Modulierung der NF-kappaB Signalkaskade bisher wenig untersucht. Um Phosphatasen zu identifizieren, die eine Rolle bei der TZR-induzierten NF-kappaB-Aktivierung spielen, wurde ein RNA Interferenz (RNAi) Screen in Jurkat T Zellen durchgeführt. Mit Hilfe dieser Methode konnten verschiedene Phosphatasen und Phosphatase-assoziierte Proteine identifiziert werden, welche die NF-kappaB-Aktivität positiv oder negativ regulieren. Entsprechend wurde die protein phosphatase 1, calalytic subunit alpha (PP1alpha) als Positivregulator identifiziert. RNAi-vermittelte Verminderung der PP1alpha-Expression führte zu einer verringerten NF-kappaB-Aktivität. Umgekehrt führte die Überexpression von PP1alpha zu einer erhöhten NF-κB-Aktivität. Es konnte jedoch kein deutlicher Einfluss von PP1alpha im Hinblick auf zytoplasmatische Phosphorylierungsreaktionen im NF-κB-Signalweg detektiert werden. Allerdings wurde festgestellt, dass PP1alpha, vermutlich Promotor-spezifisch, die Expression einzelner bona fide NF-kappaB-regulierter Gene beeinflusst. Entsprechend führte eine verringerte PP1alpha-Expression zu einer verminderten DNA-Bindeaktivität von NF-kappaB. Zudem wurde gezeigt, dass PP1alpha für die Proliferation von primären humanen CD4+ T-Lymphozyten benötigt wird. Darüber hinaus, induzierte eine verringerte PP1alpha Expression oder Inhibition der enzymatischen Aktivität der Phosphatase Apoptose in NF-kappaB-abhängigen kutanen T Zell Lymphom (engl.: cutaneous T cell lymphoma, CTCL) Zellen. In dieser Arbeit konnte ein neuer Regulator der TZR-induzierten NF-kappaB-Aktivität identifiziert werden. Diese Ergebnisse tragen zu einem genaueren Verständnis der NF-kappaB-Regulation in T Lymphozyten bei und sind möglicherweise für die zukünftige therapeutische Behandlung von NF-kappaB-assoziierten Erkrankungen von Bedeutung.

Translation of abstract (English)

The transcription factor nuclear factor-kappa B (NF-kappaB) is an essential regulator of lymphocyte activation and survival mediating expression of cytokines, growth factors and pro- and anti-apoptotic genes. Hence, NF-kappaB activation is essential to mount an efficient immune response and to eradicate potential threats. Conversely, several malignancies acquire mutations, resulting in constitutive NF-κB activity, allowing them to escape cell-intrinsic check-point mechanisms. Signal transduction to NF-kappaB, emanating from the T cell receptor (TCR), largely relies on phosphorylation of proteins, altering their localisation and activity. However, most phosphorylation events are transient. While multiple kinases and their substrates have been characterised, the role of phosphatases in modulating NF-kappaB activity is less well understood. To systematically identify phosphatases that take part in NF-kappaB signalling upon TCR engagement, a RNA interference (RNAi) genetic screen in Jurkat T cells was performed. Using this approach, several phosphatases and phosphatase-associated proteins were identified that positively or negatively regulate NF-kappaB activity. Accordingly, protein phosphatase 1, catalytic subunit alpha (PP1alpha) was identified as a positive regulator of NF-kappaB activity. While PP1alpha silencing caused decreased NF-κB activity, PP1alpha overexpression augmented NF-kappaB activity upon TCR engagement. Cytoplasmic signalling events, with respect to known phospho-sites in the NF-kappaB pathway, were not dramatically influenced by the phosphatase. However, PP1alpha was found to selectively regulate expression of a subset of bona fide NF-kappaB target genes, most likely in a promoter-specific manner. Accordingly, PP1alpha-silencing caused a significant reduction of NF-kappaB DNA binding activity. Furthermore, knock down of PP1alpha or inhibition of its phospholytic activity suppressed proliferation of primary human CD4+ T lymphocytes. In addition, PP1alpha-silencing or inhibition sensitised a malignant NF-kappaB-addicted cutaneous T cell lymphoma (CTCL) cell line towards apoptosis. In summary, the present study identified PP1alpha as a novel regulator of NF-kappaB activity in T lymphocytes and implicates the phosphatase as a factor for lymphoma survival. These findings contribute to a more datailed understanding of NF-kappaB regulation and may have implications for the treatment of NF-kappaB-associated malignancies in the future.