English Title: The role of NK cells in the cytokine mediated pathogenesis of rheumatoid arthritis

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Abstract

Das Immunsystem ist ein komplexes Netzwerk aus unterschiedlichen Zellen, Molekülen und Organen, die durch ein ebenso komplexes Netzwerk an Mediatoren wie den Zytokinen und Chemokinen verbunden sind. Bei Autoimmunkrankheiten, wie der rheumatoiden Arthritis,gerät dieses streng kontrollierte Netzwerk außer Kontrolle und die Immunzellen beginnen,körpereigene Strukturen zu zerstören. Neben autoaggressiven T- und B-Zellen, deren Wirken im Kontext der rheumatoiden Arthritis in vielen Untersuchungen beschrieben wurden, stellen die weniger untersuchten NK-Zellen aufgrund ihrer Fähigkeit, Zytokine in großen Mengen freizusetzen, eine in der Entstehung und Aufrechterhaltung von autoimmunen Prozessen ebenso wichtige Zellpopulation dar. Periphere NK-Zellen werden anhand der Expression ihrer Oberflächenmoleküle CD56 und CD16 als CD56dimCD16+ und CD56brightCD16+ definiert. Funktionell besitzen NK-Zellen, wie T-Zellen, die Fähigkeit sowohl Zytokine und Chemokine zu sekretieren und zytotoxisch entartete Zellen zu eliminieren. Neben CD56 und CD16 wurde im ersten Teil dieser Arbeit CD6 als neuer differenzieller Marker auf NK-Zellen untersucht. Ursprünglich auf T-Zellen beschrieben, zeigt sich, dass CD6 ebenfalls auf der Mehrheit der peripheren CD56dim NK-Zellen exprimiert ist. Anhand der CD56/CD16/CD6 Expression lassen sich periphere NK-Zellen von gesunden Spendern in die drei Subpopulationen CD56dimCD6+, CD56dimCD6- und CD56brightCD6- einteilen, wobei in der Peripherie die CD56dimCD6+-Fraktion gegenüber den anderen signifikant dominiert. Im Hinblick auf die Funktion von CD6 auf den CD56dim NK-Zellen konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass eine direkte Stimulation von CD6 keine Degranulation, aber die Sekretion von Zytokinen (IFNg, TNFa und IL-17) und Chemokinen (CXCL12, CXCL8, CXCL10, CXCL1) auslöst. Die CD6 Expression auf NK-Zellen beschreibt damit eine CD56dim Subpopulation, die mit einem unterschiedlichen Zytokin/Chemokin Muster korreliert. Da NK-Zellen über Zytokine/Chemokine oder den direkten Kontakt mit Immunzellen (z.B. Dendritischen Zellen oder T-Zellen) die Immunantwort steuern können, wurde im zweiten Teil dieser Arbeit ihre Rolle in der rheumatoiden Arthritis, einer autoimmunen Gelenkerkrankung, bei der proinflammatorische Zytokine maßgeblich am Entstehungsprozess beteiligt sind, untersucht. Im Vergleich zu peripherem Blut zeigt sich in der Synovialflüssigkeit von Patienten mit Arthritis und Arthrose, einer nicht autoimmunen Gelenkerkrankung, die hier als Kontrollgruppe diente, eine umgekehrte Verteilung der NK-Zell-Subpopulationen, hin zu einer Anreicherung der CD56brightCD16-CD6- NK-Zellen. Durch die Analyse weiterer NK-Zell-Marker (NKp46, NKp30, NKG2A/CD94, NKG2D) konnte die selektive Anreicherung dieser Subpopulation bestätigt werden. Von allen untersuchten Markern korrelierte die Abwesenheit von CD6 jedoch am stärksten mit der CD56brightCD16-CD6- Infiltration. Die NK-Subpopulationen unterscheiden sich ebenfalls in ihrem Chemokinrezeptor-Repertoire, wonach CD56bright NK-Zellen exklusiv CXCR3, den Chemokinrezeptor für CXCL10 (IP-10) und CXCL9 (MIG), exprimieren, wohingegen CD56dim NK-Zellen hauptsächlich CXCR1 und CXCR2, die Rezeptoren für CXCL8 (IL-8) und CXCL1 (GROa), exprimieren. Die Analyse der Chemokine in den SF und Plasmen von Arthritis und Arthrose-Patienten zeigte, dass in der SF der Patienten die CD56bright anlockenden Chemokine (CXCL10 und CXCL9), welche an einer selektive Rekrutierung dieser Zellen beteiligt sein könnten, signifikant erhöht vorliegen. Jedoch liegen in den SF ebenfalls Chemokine (CXCL8 und CXCL1) vor, welche eher CD56dim NK-Zellen rekrutieren. Die Abwesenheit der CD56dimCD16+CD6+ NK-Zellen in der SF der Patienten konnte daher nicht mit der Abwesenheit der rekrutierenden Chemokine beantwortet werden, so dass andere Mechanismen daran beteiligt sein müssen. Neben den Chemokinen wurden in dieser Arbeit auch die Zytokine in den SF und Plasmen beider Patientengruppen untersucht. Dabei zeigt sich, dass die Th1 (IFNg, IL-2, TNFa, TNFb), Th2 (IL-4, IL-10, IL-13, GM-CSF) und die TH17 (IL-17, IL-22) Zytokine, an deren Produktion NK-Zellen sowie T-Zellen beteiligt sind, ausschließlich in den SF/Plasmen der autoimmunen Arthritis-, nicht jedoch der nicht-autoimmunen Arthrose-Patienten, signifikant erhöht vorliegen. Damit konnte in dieser Arbeit eine deutliche Trennung zwischen den beiden gelenkdestruktiven Erkrankungen, anhand des Zytokinmusters, vollzogen werden, wobei die autoimmune Entzündung in der Arthritis durch ihre Th1/Th17-Immunantwort zur schlussendlichen Gelenkzerstörung führt. Im Gegensatz dazu wird dieselbe pathologische Endstrecke, die Gelenkzerstörung, in der Arthritis durch eine nicht autoimmune Entzündung erreicht. Daher lassen sich aus diesen Ergebnissen zukünftig eventuelle Strategien für eine Differentialdiagnose zur Abgrenzung zwischen Arthritis und Arthrose entwickeln.

Translation of abstract (English)

The immune system is a complex network, which consists of different organs, cells and molecules. These are connected in an equally complex manner by signalling mediators, such as cytokines and chemokines. Autoimmune diseases, like rheumatoid arthritis, are characterized by a deregulation of this tightly controlled network which results in an immune response against the host's own cells and tissues. In addition to auto-aggressive T and B cells, which are well studied in the context of rheumatoid arthritis, the less well characterised NK cells also play an important role in the initiation and maintenance of auto-immune reactions through their capability to secret large amounts of cytokines. Peripheral blood NK cells can be distinguished as CD56dimCD16+ or CD56brightCD16+ according to the expression of their surface markers CD56 and CD16. Similar to T cells, the function of NK cells is the secretion of cytokines and chemokines and the elimination of degenerated cells by direct cytotoxicity. In this work, CD6 is described as a new differentially expressed marker for CD56dim NK cells. First described on T cells, CD6 is also expressed on the majority of peripheral CD56dim NK cells. According to these new findings, peripheral NK cells in healthy donors can be classified into CD56dimCD6+, CD56dimCD6- and CD56brightCD6- NK cells whereby the CD56dimCD6+ fraction dominates in the periphery. Regarding the function of CD6 on CD56dim NK cells, it could be shown in this work that stimulation of CD6 did not result in degranulation, but secretion of cytokines (IFNg, TNFa und IL-17) and chemokines (CXCL12, CXCL8, CXCL10, CXCL1). Therefore, the expression of CD6 on NK cells characterizes a CD56dim subpopulation, which correlates with a differential pattern of cytokine/chemokine secretion. NK cells are able to coordinate the immune response either via cytokines/chemokines or via direct contact to immune cells (e.g. dendritic cells or T-cells). Therefore, the second part of this work was to describe the function of NK cells in rheumatoid arthritis, an autoimmune disease of the joints with a significant involvement of pro-inflammatory cytokines in disease development and progression. The NK cell subpopulations in the peripheral blood and in the synovial fluid were compared in patients with rheumatoid arthritis and osteoarthritis. An inverse distribution of the two NK-cell subpopulations was found, with an enrichment of the CD56brightCD16-CD6- NK cells in the synovial fluid of rheumatoid arthritis and osteoarthritis patients. Further evidence for the selective accumulation of this subpopulation was demonstrated by the analysis of additional NK-cell markers (NKp46, NKp30, NKG2A/CD94 and NKG2D). However, the strongest marker among >20 tested for the infiltration of NK cells was the absence of CD6. Furthermore, the NK-cell subpopulations differ between their chemokine receptor repertoire, with CD56bright NK cells expressing CXCR3 exclusively, which is the chemokine receptor for CXCL10 (IP-10) and CXCL9 (MIG). In contrast, CD56dim NK-cells express mainly CXCR1 und CXCR2, the receptors for CXCL8 (IL-8) und CXCL1 (GROa). The analysis of chemokines in the synovial fluid and plasma of arthritis and osteoarthritis patients showed a significant enrichment of CD56bright NK-cell attracting chemokines (CXCL10 und CXCL9), selectively recruiting these cells to the synovial fluid. However, chemokines (CXCL8 und CXCL1) recruiting CD56dim NK-cell could be found in the synovial fluid as well, demonstrating that other mechanisms must be responsible for the absence of CD56dimCD16+CD6+ NK cells in the synovial fluid. The detailed analysis of the cytokines in the SF and plasma of the two patient groups showed that the NK-cell and T-cell related cytokines Th1 (IFNg, IL-2, TNFa, TNFb), Th2 (IL-4, IL-10, IL-13, GM-CSF) and TH17 (IL-17, IL-22) were significantly enriched in the SF and plasma fractions of rheumatoid arthritis patients but not in osteoarthritis patients. For this reason, a clear discrimination between the two degenerative diseases can be made through the use of the cytokine pattern. The pathological end point of both diseases is the degeneration of the joints, whereby in rheumatoid arthritis it is reached by an immune response mediated by Th1/Th17 cells and in osteoarthritis there is no autoimmune inflammation. These findings will help to facilitate the development of a more explicit differential diagnosis between rheumatoid arthritis and osteoarthritis.