English Title: Investigation of the adhesives of marine fouling organisms using synchrotron-based X-ray techniques

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Abstract

Die als Biofouling bezeichnete Besiedelung fester, von Wasser bedeckter, Oberflächen stellt in vielerlei Hinsicht ein großes Problem dar. Eine Möglichkeit, wirksame und dennoch umweltverträgliche Gegenstrategien zu entwickeln, besteht darin, die Funktionsweise der biologischen Klebstoffe zu verstehen, mithilfe derer die Foulingorganismen auf ihren Substraten adhärieren. Im Idealfall könnten ungiftige Substanzen mit der Adhäsion bzw. Kohäsion der Klebstoffe interferieren und so die Anhaftung verhindern. Seepocken sind bedeutsame Foulingorganismen, welche mit verschiedenen Arten weltweit in allen Küstenbereichen zu finden sind. Ein entscheidender Schritt ihres Lebenszyklus stellt die permanente Adhäsion der motilen Cyprislarve dar, bevor diese die Metamorphose zur sessilen adulten Form durchläuft. Die Larve sekretiert dazu einen als Cypriszement bezeichnete Klebstoff. Die Analytik dieser Substanz wird unter anderem durch die geringe Materialmenge in Nanogrammbereich erschwert, welche von den Larven einmalig sekretiert wird. Aus diesem Grund ist über die Zusammensetzung des Cypriszements im Gegensatz zum Zement der adulten Seepocken bisher wenig bekannt. In dieser Arbeit wurde erstmals synchrotronbasierte μ-Röntgenfluoreszenzanalyse (μ-RFA) verwendet, um die Elementverteilungen in den Seepockenarten Elminius modestus, Balanus amphitrite und Balanus improvisus sowie deren Cyprislarven in vivo zu untersuchen. Die an der Synchrotronstrahlungsquelle ANKA durchgeführten Experimente lieferten erste Hinweise auf erhöhte Konzentrationen einiger Elemente im Cypriszement, allen voran Brom, deren Vorkommen bisher noch nicht beschrieben worden war. Um die Hinweise zu überprüfen, wurden anschließend mit der gleichen Methode Proben der von B. amphitrite und B. improvisus auf einem Kaptonsubstrat hinterlassenen Adhäsive in situ untersucht. Neben Brom wurden dabei auch noch weitere Elemente gefunden, deren Vorkommen in dieser Substanz bisher nicht bekannt war. Motiviert durch diese Erfolge wurde die Anwendung der μ-RFA auf weitere Foulingorganismen getestet. Erste In-vivo-Messungen bei ANKA am Kalkröhrenwurm Ficopomatus enigmaticus verliefen erfolgreich. Auch die vergleichsweise kleine marine Kieselalge Navicula perminuta konnte an der Synchrotronstrahlungsquelle PETRAIII untersucht werden. Bislang war es jedoch noch nicht möglich, Fluoreszenzsignale der adhäsiven Sekretspuren zu detektieren, die die motile Alge auf Substraten hinterlässt. Dies ist höchstwahrscheinlich auf die schwache Wechselwirkung der verwendeten harten Röntgenstrahlung mit dem sub-μm-dicken Probenmaterial zurückzuführen. Weiche Röntgenstrahlung zeigt eine deutlich stärkere Wechselwirkung. Um die Möglichkeiten zu untersuchen, die Photonen dieses Energiebereichs für eine Untersuchung mikroskopischer biologischer Proben bieten, wurde ptychographische Röntgenmikroskopie an der Synchrotronstrahlungsquelle BESSY II verwendet, um den Phasen- und Absorptionskontrast verschiedener Probentypen zu charakterisieren. Als Alternative zum Elementkontrast der RFA wurde dabei an einer Testprobe aus Mikrokugeln sowohl ptychographisch als auch mittels Vollfeldmikroskopie das Potential des NEXAFS-Kontrasts demonstriert, welcher in der Lage ist, chemische Bindungszustände zu differenzieren und somit prinzipiell geeignet erscheint, Einblicke in die Zusammensetzung biologischer Klebstoffe zu erhalten.

Translation of abstract (English)

Biofouling, the colonization of submerged surfaces is a great problem for various reasons. The development of efficient, yet environmentally safe counter strategies could be enabled by understanding the working mechanisms of the biological adhesives employed by the fouling organisms to attach to substrates. Ideally nontoxic substances could interfere with the adhesion or cohesion of the glue preventing the attachment. Acorn barnacles are important fouling organisms. Various species are found in coastal regions all over the world. The permanent adhesion of their motile cypris larva before undergoing metamorphosis into the adult form is a crucial step in their lifecycle. In order to attach to the substrate, the larva secrets an adhesive called cyprid cement. The chemical analysis of this substance is mainly hindered by the minute amounts in the nanogram range that are secreted only once by the cypris larva. Due to this fact less is known of the composition of the cyprid cement compared to the cement secreted by adult barnacles. In the course of this work synchrotron-based μ-X-ray fluorescence (μ-XRF) was used for the first time to determine the elemental distributions in barnacle species Elminius modestus, Balanus amphitrite and Balanus improvisus and cypris larva in vivo. Experiments performed at the synchrotron radiation source ANKA indicated elevated concentrations of various elements in the cyprid cement, among them bromine, which had not been described before. In order to verify the results in situ samples of the cyprid cement left on a Kapton substrate were analyzed using the same technique. The results confirmed the previously unknown presence of bromine and various metals in this substance. Motivated by this success the application of μ-XRF to other fouling organisms was evaluated. First in vivo experiments at ANKA with the tube worm Ficopomatus enigmaticus proved successful. The comparably small marine diatom alga Navicula perminuta could be investigated at the synchrotron radiation source PETRAIII. Up to now, however, it was impossible to detect fluorescence signals from the adhesive trails left by the motile alga on substrates. The probable reason for this is the weak interaction of hard X-rays with the sub-μm thin sample material. Soft X-rays exhibit a much stronger interaction. In order to evaluate the potential of this spectral range for the investigation of microscopic biological samples, ptychographic soft X-ray microscopy was performed at the synchrotron radiation source BESSY II to determine the phase and absorption contrast of different types of samples. As an alternative to the elemental contrast provided by XRF, the potential of the NEXAFS contrast mechanism revealing chemical bonding states was demonstrated using ptychography as well as full field microscopy on a microsphere test sample. This contrast mode appears generally suited to provide insights into the composition of biological adhesives.