English Title: Single molecule fluorescence studies of nucleosome dynamics

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Abstract

Eukaryontische Zellen weisen neben einer hochgradig organisierten Genregulation auch eine besonders ausgefeilte Kompaktierung der DNA auf, deren Basiseinheit Nukleosomen sind. Diese bestehen aus einem Histonkern mit je zwei Kopien der einzelnen Histonproteine – H2A, H2B, H3 und H4 – und einer 147 bp langen DNA, die in 1,7 Windungen um den Histonkern gewickelt ist. Im Chromatin sind die einzelnen Nukleosomen über DNA-Linker (10 – 90 bp) miteinander verbunden. Die Konformation dieses Komplexes kann durch posttranslationale Modifikation der Proteine und der DNA verändert werden. Von besonderer Bedeutung sind hierbei die aus dem Histonkern herausragenden H3-Histonschwänze, deren Deletion zur Destabilisierung des Komplexes führt. Aus Simulationen lässt sich schließen, dass dies mit Veränderungen der elektrostatischen Umgebung im inneren des Histonkerns, der α3-Region des H2A-Histonproteins, einhergeht. Da bis heute unklar ist, ob die elektrostatische Umgebung dieser Region einen direkten Einfluss auf die Stabilität hat, wurde in dieser Arbeit der Einfluss von Mutationen der Positionen R81 und R88 des H2A-Histonproteins auf die Nukleosomenarchitektur und –Stabilität analysiert. Hierfür wurde ein Aminosäureaustausch zu Alanin bzw. zu Glutaminsäure durchgeführt und dessen Einfluss mit Hilfe von Förster-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) charakterisiert. FRET bezeichnet einen distanzabhängigen, strahlungsfreien Energie-Transfer zwischen zwei Fluorophoren und kann als Maß für Distanzveränderungen im Bereich von 2 – 10 nm verwendet werden. Durch den Vergleich von mutierten und Wildtyp-Nukleosomen unter Verwendung verschiedener Markierungsstrategien konnte eine durch die Mutationen hervorgerufene Destabilisierung detektiert werden. Deren jeweiliges Ausmaß lässt Rückschlüsse auf die Relevanz der Position (SWt > SR88 > SR81 > SR81R88), sowie der Ladung (SRA > SRE) der eingebrachten Mutation für die Stabilität der Nukleosomen zu. Eine Einzelmolekülanalyse der salzinduzierten Öffnung der Nukleosomen weist auf eine Schwächung der Dimer:Tetramer-Interaktion als Grund für die Destabilisierung hin. Im zweiten Teil der Arbeit wurden die Dynamik und die intranukleosomalen Wechselwirkungen des H3-Histonschwanzes näher betrachtet. Hierfür wurde unter Verwendung von zwei mutierten H3-Histonproteinen (H3K4C und H3K9C) eine neue Markierungsstrategie etabliert. Die Ergebnisse weisen daraufhin, dass Interaktionen im Bereich der Dyadenachse auftreten und diese einen dynamischen Prozess darstellen. Es kann daher davon ausgegangen werden, dass die intranukleosomalen Interaktionen des H3-Histonschwanzes das Nukleosoms stabilisieren.

Translation of abstract (English)

Chromatin compaction is one of the most sophisticated features of eukaryotic cells. The basic packing unit of chromatin are nucleosomes. The protein octamer of nucleosomes is build up by two copies of each histone protein (H2A, H2B, H3, H4), around which 147 bp of DNA are wrapped. In the chromatin Single nucleosomes are connected through linker DNAs of approximately 10 – 90bp. The conformation of this complex can be modified by posttranslational modifications on the DNA and/or histoneproteins. Of particular importance for the conformation and stability of the nucleosome are the N-terminal tails, which protrude from the nucleosome core. It is known that a deletion of the H3 tail leads to a destabilisation of the entire complex. A comparison of molecular dynamics simulations of wildtype and H3 tailless nucleosomes show a changed electrostatic environment in the α3 region of H2A within the octamer core. Whether the changed electrostatic environment fosters the destabilisation or not is not yet known. To address this question site-specific mutations in H2A at position R81 and R88 to Alanine or Glutamic acid were introduced. The influence of this amino acid exchange was analysed using Förster resonance energy transfer (FRET). FRET - a distance dependent, nonradiative energy transfer between two fluorophores - can be used to measure distances between 2 – 10 nm. With the help of different labelling strategies and direct comparison between wildtype and mutated nucleosomes I was able to detect the proposed destabilisation upon the changed electrostatic environment. The variation in stability elucidates the relevance of both position (SWt > SR88 > SR81 > SR81R88) and charge (SRA > SRE) of the amino acids. Single molecule FRET studies further revealed that the destabilisation might be caused by a weakened dimer:tetramer interface. The second part focuses on the dynamics and intranucleosomal interactions of the N-terminal tail of H3. Mutated versions of H3 - H3K4C and H3K9C - were used to establish a new labelling strategy. The results suggest a dynamic interaction of the H3 tail and the DNA in the vicinity of the dyad axis. Those intranucleosomal interactions of the N-terminal tail of H3 are presumably stabilising the entire nucleosome.