German Title: Kollektive Bewegung und Adhäsindynamik von Plasmodium Sporozoiten

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Abstract

To fulfill its complex life cycle Plasmodium needs to cross various tissue barriers and invade specific cell types. Its journey inside the mosquito involves active invasion of sporozoites into salivary glands from where these motile forms can be transmitted to the host. To perform active movement inside the mosquito as well as the skin and liver of the host, sporozoites possess an uncommon form of locomotion termed “gliding motility”. Force required for motility is generated by an actin ‐ myosin motor complex and currently thought to be transduced to the sporozoite environment via surface adhesins belonging to the TRAP family. Sporozoites are curved and highly polarized cells capable of active circular movement in vitro. For the first time, our group has observed collective motion of sporozoites within infected salivary glands of Anopheles stephensi mosquitoes following preparation. Most interestingly we observed them to form circling formations, which we termed “vortices” containing up to a hundred sporozoites as well as “swarms” of two to seven sporozoites gliding closely associated to each other. The first part of my thesis was to reach a deeper understanding of these collective migration phenomenons. Here, I show that vortices and swarms emerge from “resting” stacks of sporozoites that redistribute from the central gland cavity to the gland periphery during the preparation process and actively start to migrate individually at the basal membrane surrounding the gland. I further observed vortices to form over several minutes and be stable for hours whereas swarms form in the range of seconds and are stable for up to several minutes. Analysis of basic physical parameters of vortices (e.g. size, speed, angular speed and curvature) helped to broaden our understanding of their characteristics. Most interestingly, we observed vortices to consist of one up to several layers. Investigation of two mutant parasite lines revealed that sporozoites lacking the actin bundling protein coronin are still able to form vortices as well as swarms besides showing aberrant gliding on glass. In contrast, sporozoites lacking the chaperone HSP20 completely fail to form vortices and swarms. In the second part of my thesis I focused on the interplay of the three known sporozoite adhesins (TRAP, S6 and TLP), which have already been characterized independently throughout various studies and are known to play a major role in invasion and gliding motility of sporozoites. As a first step, I used double homologous recombination to create the double knockouts (ΔTRAP/ΔS6, ΔTLP/ΔTRAP and ΔTLP/ΔS6), two independent triple knockout lines (ΔTRAP/ΔTLP/ΔS6) as well as the TRAP complemented ΔTLP/ΔS6 line. Characterization of the generated lines confirmed the dominating TRAP and S6 phenotype blocking and strongly reducing sporozoite salivary gland invasion, respectively. I further demonstrate that once inside the salivary gland, TLP/S6 knockout sporozoites are still capable to undergo natural transmission via mosquito bites. Astonishingly, triple knockout sporozoites in the mosquito hemolymph can still attach and show the so-called patch gliding behavior, a limited form of gliding, indicating the existence of at least one further surface adhesin involved in gliding motility. Taken together, this study provides fundamental insights into the previously undescribed collective motion of Plasmodium sporozoites which might serve as model system for future studies and broadened our understanding of the interplay of sporozoite surface adhesins.

Translation of abstract (German)

Um seinen komplexen Lebenszyklus zu durchlaufen, muss Plasmodium verschiedene Zellbarrieren überwinden und in spezifische Zellarten eindringen. Seine Reise innerhalb des Moskitos beinhaltet unter anderem die aktive Invasion von Sporozoiten in die Speicheldrüse, von wo aus diese bewegliche Form des Parasiten in den Wirt übertragen werden kann. Um sich innerhalb des Moskitos, der Haut, sowie Leber des Wirtes aktiv zu bewegen, besitzt der Sporozoit eine ungewöhnliche Art der Fortbewegung, die als „gliding motility“ bezeichnet wird. Die Kraft, die für diese Art der Bewegung benötigt wird, wird von einem Aktin-Myosin Motorkomplex erzeugt und wird nach derzeitigem Verständnis über Oberflächenproteine – den Adhäsinen der TRAP Familie – an die Umgebung des Parasiten übertragen. Sporozoiten sind gekrümmte, stark polarisierte Zellen und dazu fähig sich in vitro aktiv und kreisförmig zu bewegen. Erstmalig hat unsere Arbeitsgruppe die kollektive Bewegung von Sporozoiten innerhalb von infizierten Speicheldrüsenpräparaten von Anopheles stephensi Moskitos beobachtet. Interessanterweise haben wir gesehen wie sie kreisende Formationen aus bis zu hundert Sporozoiten bildeten, die wir „Wirbel“ genannt haben. Weiterhin konnten wir bewegliche „Schwärme“ bestehend aus zwei bis sieben dicht assoziierten Sporozoiten beobachten. Der erste Teil meiner Arbeit beschäftigt sich damit, ein tieferes Verständnis dieser Phänomene der kollektiven Bewegung zu erlangen. Hierbei zeige ich, dass Wirbel und Schwärme aus „ruhenden“ Sporozoitenstapeln hervorgehen, die sich während des Präparationsvorgangs von der zentralen Speicheldrüsenhöhle in die Peripherie der Speicheldrüse verteilen und sich zunächst als einzelne Sporozoiten an der umgebenden Basalmembran entlang bewegen. Weiterhin konnte ich beobachten, wie sich „Wirbel“ innerhalb von Minuten formieren und über mehrere Stunden stabil bleiben, wohingegen sich Schwärme innerhalb von Sekunden bilden und sich nur mehrere Minuten stabil bewegen. Eine Analyse der grundlegenden physikalischen Parameter (z.B. Größe, Geschwindigkeit, Winkelgeschwindigkeit und Krümmung) half uns, unser Verständnis über deren Eigenschaften zu erweitern. Interessanterweise konnten wir beobachten, dass Sporozoiten-Wirbel aus einer oder mehreren Schichten bestehen. Die Untersuchung zweier mutierter Parasitenlinien offenbarte, dass Sporozoiten, denen das Aktin-bündelnde Protein „Coronin“ fehlt, weiterhin Wirbel und Schwärme ausbilden, auch wenn sie sich auf Glas nur sehr eingeschränkt fortbewegen. Im Gegensatz hierzu bilden Sporozoiten, denen das Chaperon „HSP20“ fehlt, keine Wirbel und Schwärme aus. Im zweiten Teil meiner Arbeit fokussiere ich mich auf das Zusammenspiel der drei bekannten Sporozoiten-Adhäsine (TRAP, S6 und TLP), welche bereits unabhängig voneinander in verschiedenen Studien untersucht worden sind und eine zentrale Rolle bei der Invasion und Fortbewegung der Sporozoiten spielen. Als ersten Schritt habe ich die doppelt homologe Rekombination genutzt, um die jeweiligen Doppel-Knockoutlinien (ΔTRAP/ΔS6, ΔTLP/ΔTRAP und ΔTLP/ΔS6), zwei unabhängige Tripel-Knockoutlinien (ΔTRAP/ΔTLP/ΔS6), sowie hieraus eine mit TRAP komplementierte zweite ΔTLP/ΔS6 Linie zu generieren. Die Charakterisierung der generierten Parasitenlinien bestätigte den dominanten TRAP und S6 Knockout Phänotyp, der jeweilig entweder zu einer vollständigen Blockade oder stark verringerten Speicheldrüseninvasion führt. Weiterhin zeige ich, dass ∆TLP/∆S6 Sporozoiten weiterhin auf natürlichem Weg durch einen Moskitostich übertragen werden können. Erstaunlicherweise waren Tripel Knockout Sporozoiten aus der Hämolymphe des Moskitos weiterhin im Stande sich an einer Glasoberfläche anzuheften und ein sogenanntes „patch gliding“ - Bewegungsmuster zu zeigen, eine Art der eingeschränkten Bewegung. Dies deutet darauf hin, dass zumindest ein weiteres Oberflächenprotein existiert, welches an der Bewegung der Sporozoiten beteiligt ist. Zusammenfassend liefert diese Arbeit grundlegende Einsichten in die bislang unbeschriebene kollektive Bewegung von Plasmodium Sporozoiten, welches als zukünftiges Modelsystem dienen könnte und erweitert unser Verständnis über die Zusammenwirkung der Oberflächenadhäsine der Sporozoiten.