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Abstract

During the process of clathrin-mediated endocytosis (CME), an invagination of the plasma membrane is formed which finally gets pinched off to form an intracellular vesicle. CME is essential for cellular function as it is important for the uptake of nutrients, regulation of signaling, and membrane homeostasis. The machinery mediating CME consists of more than 50 different proteins which are conserved from yeast to mammals. Dynamic high-resolution studies of CME remain challenging due to the small scale (≈ 250 nm) and the fast sequence (≈ 20 s) of the process. This leaves the underlying mechanisms by which spatial rearrangements of endocytic components drive membrane invagination poorly understood.

In this work, we established a new approach to dynamically reconstruct the mobile phase of CME in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae at the nanoscale from static super-resolution snapshots. The approach is based on dual-color single-molecule localization microscopy (SMLM) of hundreds of endocytic sites that have been fixed at random points along the regular timeline of endocytosis. We introduced a reference structure composed of two endocytic proteins to sort the sites temporally and align them spatially by fitting a geometric model. Imaging of this reference structure in the first channel alongside an endocytic (query) protein in the second channel allowed us to reconstruct the temporal rearrangements of the query protein.

To obtain large datasets with high quality, we increased the throughput of dual-color SMLM by testing different imaging buffers. Sealing of the sample holder turned out to be crucial to maintain good imaging conditions. Furthermore, we developed a computational pipeline to automatically segment and coarsely align endocytic sites from high-throughput datasets. The segmented sites were then fitted with a geometric model based on previous knowledge from super-resolution and electron microscopy studies. This fitting process helped us to retrieve parameters from the SMLM data which were used for spatial and temporal alignment. Importantly, the fitting is only performed on the reference channel, imposing no structural assumptions on the query protein.

We first validated that the reference structure can be used to temporally sort endocytic sites and then successfully demonstrated that our approach can faithfully recover the structural rearrangements of four proteins exemplary for different endocytic modules. Future progress will enable us to integrate multiple datasets into a single dynamic reconstruction of yeast CME with multiple query proteins.

Translation of abstract (German)

Während Clathrin-vermittelter Endozytose (engl. clathrin-mediated endocytosis, CME) wird die Plasmamembran eingestülpt und letztendlich abgeschnürt, was zur Bildung eines intrazellulären Vesikels führt. CME ist essentiell für die Funktion von Zellen, da sie für die Aufnahme von Nährstoffen, die Regulation der Signalübertragung und die Membranhomöostase wichtig ist. Die Maschinerie, die die CME vermittelt, besteht aus über 50 Proteinen, die von Hefe bis zu Säugetieren konserviert sind. Dynamische hochauflösende Studien von CME sind auf Grund der geringen Größe (≈ 250 nm) und des schnellen Ablaufs (≈ 20 s) des Prozesses eine Herausforderung. Deshalb sind die Mechanismen, wie strukturelle Veränderungen der Maschinerie die Einstülpung der Plasmamembran antreiben, nur unzureichend verstanden.

In dieser Arbeit haben wir eine neue Methode entwickelt, mit der wir die Dynamik der mobilen Phase von CME in der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae aus statischen hochaufgelösten Einzelaufnahmen rekonstruieren können. Die Methode beruht auf Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie (engl. single-molecule localization microscopy, SMLM) in zwei Farben von hunderten endozytotischen Strukturen, die zu zufälligen Zeitpunkten während des gleichmäßigen Ablaufs der Endozytose fixiert wurden. Die endozytotischen Strukturen beinhalten eine von uns eingeführte Referenzstruktur, die aus zwei markierten Proteinen besteht und uns dabei hilft, die Einzelaufnahmen durch Fitten eines geometrischen Modells zeitlich zu sortieren und räumlich auszurichten. Wenn wir SMLM-Daten von dieser Referenzstruktur zusammen mit einem weiteren endozytotischen Protein im zweiten Kanal aufnehmen, können wir die strukturellen Veränderungen dieses zusätzlichen Proteins rekonstruieren.

Um große Datensätze mit hoher Qualität aufzunehmen, haben wir den Durchsatz der Zweifarben-SMLM gesteigert, indem wir verschiedene Probenpuffer getestet haben. Dabei hat sich die Versiegelung des Probenhalters als entscheidend erwiesen, um gute Bedingungen für die Mikroskopie aufrechtzuerhalten. Außerdem haben wir einen computergestützten Algorithmus entwickelt, um die endozytotischen Strukturen aus den Hochdurchsatz-Daten automatisch zu segmentieren und grob auszurichten. Die Strukturen wurden dann mit einem geometrischen Modell gefittet, das auf Vorwissen aus SMLM- und Elektronenmikroskopie-Studien basiert. Dieser Fitting-Prozess hat uns dabei geholfen, Parameter aus den SMLM-Daten zu gewinnen, die für die zeitliche Sortierung und räumliche Ausrichtung der Strukturen verwendet wurden. Ein wichtiger Punkt dabei ist, dass nur die Referenzstruktur gefittet wird und dadurch die Struktur des Proteins im zweiten Kanal unabhängig ist.

Wir haben zunächst validiert, dass die Referenzstruktur für die zeitliche Sortierung der endozytotischen Strukturen verwendet werden kann, und dann erfolgreich demonstriert, dass unsere Methode die strukturellen Veränderungen von vier unterschiedlichen Proteinen im zweiten Kanal, die exemplarisch für verschiedene endozytotische Module stehen, zuverlässig rekonstruieren kann. Künftige Fortschritte werden es uns ermöglichen, Datensätze mit verschiedenen endozytotischen Proteinen im zweiten Kanal zu einer dynamischen Rekonstruktion der CME in Hefe zu kombinieren.