German Title: Manipulation von Punktabbildungsfuntionen in der Fluoreszenzspektroskopie

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Abstract

Die Synthese von Mikroskopie und Fluoreszenzspektroskopie hat das Mikroskop in ein vielseitiges Werkzeug zur funktionelle Analyse biologischer Systeme verwandelt. In dieser Arbeit wird untersucht, ob und wie kürzlich entwickelte Techniken zur Manipulation von Punktabbildungsfunktionen neue spektroskopische Anwendungen im Mikroskop hervorbringen können. Die Ableitung einer einfachen Integraldarstellung der Fouriertransformation der fokalen Intensitätsverteilung schafft die Grundlage für die numerische Modellierung dynamischer, intensitätsabhängiger Prozesse im Fokus. Als nächstes wird Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie mit Detektionsvolumina, deren beugungsbegrenzte Einhüllende periodisch moduliert ist, theoretisch beschrieben. Darauf aufbauend wird ein �Diffusions- und Strömungsmikroskop� mit hoher räumlicher Auflösung vorgeschlagen. Sein Aufbau ähnelt dem eines multifokalen 4Pi-Mikroskops und seine Fähigkeit, die Parameter anisotroper Diffusion und die Strömungsrichtung und -geschwindigkeit in einer Flüssigkeit zu bestimmen, wird in simulierten Messungen demonstriert. Zuletzt wird aufgezeigt und experimentell verifiziert, dass Entvölkerung durch stimulierte Emission (stimulated emission depletion) dazu verwendet werden kann, zwischenmolekularen Förster-Energie-Transfer in einer Probe zu identifizieren.

Translation of abstract (English)

The combination of high resolution imaging withfluorescence spectroscopy has rendered the microscope into a powerful tool for functional analysis of biological specimens. This thesis explores the potential of techniques, that are usually utilized for PSF-engineering, for the development of new spectroscopical applications. The derivation of a simple integral solution for the Fourier transform of the vectorial PSF lays the foundation for numerical modelling of dynamical, intensity dependent processes in the focal region. Subsequently a theory describing the combination offluorescence correlation spectroscopy with diffraction limited, periodically modulated detection volumes is derived. This idea leads to the proposal of a 'diffusion and flow microscope� with high spatial resolution. It is readily implemented in a multifocal 4Pi microscope and its potential to extract the parameters of anisotropic diffusion as well as speed and direction offlow inside a fluid is demonstrated in simulations. Finally, experimental evidence is presented that depletion by stimulated emission can be used to identify Förster energy transfer between two molecules inside a sample.