English Title: Characterisation of an in vitro-skin model to study epidermal regeneration, dermal histogenesis and endothelial vaskulogenesis

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Abstract

Die humane Haut besteht aus einem mehrschichtig differenziertem Plattenepithel, der Epidermis, das mittels der Basalmembran mit dem Bindegewebe (Dermis) verankert ist. Die Epidermis befindet sich dabei im Zustand der Homöostase, also der ständigen Selbsterneuerung bei gleichzeitiger Desquamation, und eignet sich als ideales Modell, um epidermale Differenzierung, Regeneration und anfängliche Stadien der Wundheilung zu studieren. Diesbezüglich stellen in vitro-Systeme einen Mittelpunkt der biologischen Grundlagenforschung dar, um diese regulatorischen Mechanismen der Zell-Zell- und Zell-Matrix-Interaktionen aufzudecken. In den letzten Jahrzehnten wurden eine Reihe sogenannter dreidimensionaler organotypischer Kokulturen entwickelt, die zumeist basierend auf einer Fibroblasten-besiedelten Matrix die epidermale Differenzierung von luftexponiert kokultivierten Keratinozyten ermöglichen. An diesen Kultursystemen wurden die fundamentalen Erkenntnisse erarbeitet, dass epidermale Vorgänge zwar auch autokrin, jedoch maßgeblich mesenchymal reguliert werden. Diese konventionellen in vitro-Kurzzeit-Kulturen sind allerdings nicht geeignet, um konsolidierende Prozesse wie die epidermale Homöostase näher zu beleuchten, was die Entwicklung und Charakterisierung adäquater Langzeit-Modelle erfordert. In der vorliegenden Arbeit wurden die Bedingungen für ein Langzeit-Hautäquivalent etabliert, um die Kultivierung von Keratinozyten bis zu vier Monaten zu ermöglichen. Die Keratinozyten generierten dabei ein mehrschichtiges Epithel, dessen reguläre Architektur auch nach mehreren Wochen erhalten blieb. Für das Erreichen einer epidermalen Gewebshomöostase sprachen die in vivo-typische Anordnung von Differenzierungsmarkern, die Bildung einer funktionellen epidermalen Barriere, die normalisierte Proliferationsregulation sowie die Formation einer regulären Basalmembranzone. Im dermalen Kompartiment des Hautäquivalentes wurde die Produktion einer authentischen Bindegewebsmatrix verfolgt. Fibroblasten wurden anfangs in ein gerüststabilisiertes Fibringel suspendiert, woraufhin die Synthese provisorischer extrazellulärer Matrixproteine begann. Später wurden Kollagen- und elastische Fasern de novo synthetisiert, worin sich nicht nur das regenerative Potential des Hautmodells offenbarte, sondern auch die fortschreitende Ausbildung physiologischer Bedingungen in demselben. Erst damit scheint eine geeignete Mikroumgebung, eine Stammzell-Nische, gegeben zu sein, die die Langzeit-Kultivierung von Keratinozyten mit Erreichen einer epidermalen Homöostase bewirkt. Die Kultivierung unterschiedlicher Zelltypen in einem System ist das Ziel in der Entwicklung von in vitro-Modellen. Ein Zelltyp, der sowohl in der Normalsituation der Haut wie in zahlreichen pathologischen Prozessen eine zentrale Stellung einnimmt, ist die Endothelzelle, die die Wandung der Blutgefäße darstellt. Nachdem vor 30 Jahren erstmals gefäßartige Strukturen in vitro gezüchtet werden konnten, wurden für die Erforschung der Vaskulogenese und Angiogenese weitere Zellkultursysteme etabliert. Das Potential, Endothelzellen als dritten Zelltyp in das Hautäquivalent aufzunehmen, sollte in der vorliegenden Arbeit getestet und die endotheliale Histogenese bewertet werden. Dabei stellte sich heraus, dass die Endothelzellen nach Inokulation als Einzelzellen in der Lage sind, innerhalb der dermalen Matrix des Hautmodells zahlreiche Gefäße eigenständig zu generieren. Diese kapillarähnlichen Strukturen beherbergten ein Lumen und wurden durch eine endotheliale Basalmembran sowie Adhärenzverbindungen gekennzeichnet. Es zeigte sich, dass die Keratinozyten einen wesentlichen Einfluss auf die reguläre endotheliale Morphogenese ausüben, denn bei deren Abwesenheit wurden nahezu keine Kapillarstrukturen gebildet. Zusammengefasst wurde hier ein Hautmodell entwickelt und charakterisiert, dessen Einsatz zukünftig ein weitergehendes Studium epithelial-mesenchymaler Interaktionen während der Regeneration und in der Gewebshomöostase ermöglichen wird und ein wichtiges Werkzeug für die noch ausstehende Charakterisierung der epidermalen Stammzell-Nische sein wird. Zusätzliches Potential liegt in der Verwendung als vaskularisiertes Hautäquivalent, mit dem Abläufe während der Neovaskularisierung sowie der Regulation der Tumorangiogenese aufgedeckt werden können.

Translation of abstract (English)

Human skin is a complex, multilayered organ, which consists of a stratified, continually renewing epithelium (epidermis) and the connective tissue (dermis). Cohesion between both compartments is ensured by the basement membrane zone. Epidermal homeostasis is understood as the maintenance of tissue integrity by a fine tuned mechanism balancing proliferation and cell loss by desquamation. Thus, the epidermis is ideally suited for studying epidermal differentiation, regenerative processes, and initial stages of wound healing. For this purpose, in vitro models gain importance as tools in basic research to investigate the regulatory mechanism of cell-cell and cell-matrix interactions. During the last decades three-dimensional organotypic cocultures have been developed, consisting of epidermal keratinocytes growing air-exposed on dermal matrices with incorporated fibroblasts. Those culture models have been exploited successfully as experimental tools to the better understanding of mutual paracrine mechanisms in epithelial-mesenchymal interactions controlling epidermal regeneration. However, the restricted lifespan of these short-term skin models limited their use in elucidating the mechanisms regulating skin homeostasis, indicating the need for further optimisation. The objective of this study was to create a stable in vitro model for long-term culture. This was achieved by elaborating an optimised protocol for long-term cultivation of a skin equivalent exhibiting a superior epidermal architecture with renormalised differentiation and ultrastructure. The regular differentiation, the formation of a functional epidermal barrier, the renormalised keratinocyte growth rates, and the rapid maturation of a basement membrane zone are altogether features fulfilling the criteria of tissue homeostasis. Furthermore, a progressive maturation of the dermal part of the skin equivalent became evident by a significant remodelling of the dermal matrix changing from an initial provisional status to an extracellular matrix with an in vivo-like composition (containing collagen and elastic fibres). This authentic microenvironment, the so-called stem cell niche, in turn, is a prerequisite for the longevity of keratinocytes, as well as the maintenance of epidermal homeostasis. One major challenge in the development of in vitro models is the cultivation of several cell types in one system. Endothelial cells line blood vessels and play critical roles in a large number of physiologic and pathologic processes such as inflammation, wound healing, and angiogenesis. The spontaneous organisation of capillary-like structures in vitro was first observed almost 30 years ago paving the way for the development of various vasculogenesis and angiogenesis in vitro models. The skin equivalent presented herein represents a microenvironment ideal for endothelial cells, allowing their self-assembly into numerous tube-like structures. These capillaries were characterised by an intercellular lumen, an endothelial basement membrane, and adherence junctions. In addition, keratinocytes were found to have crucial impact on regular endothelial morphogenesis since their absence effected endothelial cells to barely form capillary-like structures. In summary, an in vitro skin equivalent has been characterised that represents an ideally suited long-term model to study the regulatory mechanisms controlling epithelial-mesenchymal interactions during tissue homeostasis, and the establishment and maintenance of a stem cell niche. Moreover, the vascularised skin model facilitates the investigation of the regulation of neovascularisation and tumour angiogenesis.