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Characterization of spontaneous tumor antigen-reactive T cell responses in melanoma patients and treatment of human melanoma with optimized T cell receptor transgenic T cells in a xenotransplantation model

Pfirschke, Christina

German Title: Charakterisierung von spontanen Tumorantigen-reaktiven T-Zellantworten in Melanompatienten und Behandlung von humanen Melanomen mit optimierten T-Zell-Rezeptor-transgenen T-Zellen in einem Xenotransplantationsmodell

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One of the leading human malignancies is cancer, a disease characterized by mostly uncontrolled growth of abnormal cells in the body, often forming metastases. It´s interaction with the immune system, that can influence the disease progression, has repeatedly been reported and gained increasing importance over the last decades. However, most of the current immunotherapeutic approaches for cancer treatment are limited, partly due to the immune controlling capacities of tumors. The development of novel experimental approaches and therapeutic strategies, that support and complement the tumor-directed pre-existing abilities of the immune system, will be critical for the success of future cancer immunotherapies. Therefore, and because of the general need of novel treatment strategies, the presented thesis focused on four different approaches to optimize cancer immune therapeutic interventions. Functionally competent tumor-specific memory T cells have been reported to efficiently control tumor growth and be required for a durable prevention of tumor recurrence and metastasis formation. Therefore, the first project dealed with spontaneously induced tumor antigen-reactive memory T cell responses in the peripheral blood (PB) of melanoma and dysplastic nevi patients. Thereby, using a short-term IFNgamma ELISPOT assay, high frequencies of pre-existing T cell responses were detected in both cohorts ex vivo. As antigen-presenting cells, I have used autologous dendritic cells, generated from monocytes which were pulsed with 13 different 50 amino acid long synthetic melanoma polypeptides, derived from immunodominant regions of tumor-associated antigens (TAAs). Thereby, the nature of the identified T cell responses revealed to be polyvalent and HLA-unrestricted. Moreover, the designed polypeptide sequences, that covered MHC class I- and II-restricted epitopes, are optimal for presentation on a wide range of HLA types and therefore, were recognized by CD4+ and CD8+ T cells. I have shown that the long peptide sequence of the NA17-A antigen induce high frequencies of NA17-A-reactive memory T cells, but not NA17-A-specific regulatory T cell (Treg) responses. Thus, particular importance for future vaccination approaches might therefore have to be considered. Furthermore, the demonstration that the TAA-reactive T cell frequencies increased after resection of the non-metastasized tumors or dysplastic nevi indicates that the presence of the lesions controls pre-existing T cell responses. Additionally, these investigations also showed antigen-specific Treg in the PB and revealed that, in some patients, Treg have an immunosuppressive potential. In general, however, an essential role of Treg in controlling spontaneous T cell responses in non-metastasized melanoma and dysplastic nevi patients could not be detected. Based on these findings, besides Treg, the tumor- or lesion-mediated TAA-reactive memory T cell suppression might also be facilitated through other potential effectors of immunosuppression, including combinations of soluble and cellular mediators. Summarized, the investigated polypeptides efficiently elucidated pre-existing T cell responses in melanoma and dysplastic nevi patients and thus indicate that those polyvalent responses could be therapeutically reactivated in consequence of an appropriate peptide vaccination treatment. For the second optimization approach a human melanoma murine xenotransplantation model has been established. Thereby, the in vivo efficiency and biologic relevance of human T cells, which were transduced with functionally expressed, in vitro optimized, T cell receptor (TCR) constructs, specific for the antigens MDM2 or gp100 were investigated. For the first time in vivo, two novel strategies that aimed to avoid hybrid mispaired TCR chain formation and thereby potential autoimmune disease-causing “off-target” reactions were tested. These approaches comprised the molecular design of the TCR alpha/beta interphase and a single chain TCR framework. Thereby, optimized MDM2 as well as gp100 transgenic T cells revealed the ability to significantly control human melanoma tumor growth. Moreover, the engineered T cells persisted in vivo and controlled in the same animals even a secondary tumor growth in a memory T cell-like manner. I could also demonstrate that a combinational treatment of adoptive T cell therapy using TCR gene-modified human T cells with local low dose tumor irradiation (2 Gy), led to an improved T cell targeting into the tumor and additionally further increased the tumor growth control. Consequently, in order to improve adoptive cancer immunotherapeutic approaches the in vivo experiments confirmed the feasibility and efficiency of the applied TCR design. In the third project presented in this thesis, a novel tumor cell-mediated immunosuppressive mechanism, facilitated by the cell adhesion molecules CEACAM6 and L1CAM, was addressed. Thereby, these molecules were detected in various tumor cell lines and using short-term IFNgamma ELISPOT and 51Cr release cytotoxicity assays it could be shown that their specific blockade resulted in increased, functional effector T cell responses. Therefore, in order to modulate the strength of T cell responses against malignant edited tumor cells that escaped immune recognition, CEACAM6 and L1CAM may consequently be attractive targets for novel immunotherapeutic interventions. Finally, to increase the capacity of oncolytic virotherapies, in a fourth project, I optimized the viral transport of the Newcastle disease virus (NDV) to human tumor cells. In this approach, the loading of human T cells with NDV was specified for the first time in an in vitro co-culture system. Moreover, in a “hitchhiking”-like mechanism T cells have shown to be capable to transfer cell surface-attached NDV to MCF-7 tumor cells. In addition, monolayers of tumor cells were efficiently destroyed through oncolytic NDV-modified activated T cells. Based on this combinational therapy, it can be proposed that effector T cells can facilitate as potent carrier vehicles to transport NDV to tumor sites, resulting in focused tumor cell destruction. In summary, the findings of the four different approaches, presented in this thesis, indicate novel perspectives for the optimization of future immunotherapeutic interventions in order to elicit and support protective T cell responses against clinically apparent malignant tumors.

Translation of abstract (German)

Krebs stellt eine der führenden malignen Erkrankungen beim Menschen dar und ist durch unkontrolliertes Wachstum von entarteten Körperzellen und die Bildung von Metastasen gekennzeichnet. Die Wechselwirkung von Krebs mit dem Immunsystem, welche die Krankheitsentwicklung beeinflussen kann, wurde wiederholt beschrieben und hat in den letzten Jahrzehnten an zunehmender Bedeutung gewonnen. Dennoch zeigen gegenwärtig die meisten immuntherapeutischen Ansätze zur Krebsbehandlung nur eine begrenzte Wirksamkeit, teilweise hervorgerufen durch immunkontrollierende Eigenschaften von Tumoren. Die Entwicklung von neuen experimentellen Ansätzen und therapeutischen Strategien, welche die vorhandenen, tumorgerichteten Fähigkeiten des Immunsystems unterstützen und zusätzlich ergänzen, wird für den Erfolg zukünftiger Krebsimmuntherapien von entscheidender Bedeutung sein. Aus diesem Grund und wegen des generellen Bedarfs an neuen Strategien, beschäftigte sich die vorliegende Doktorarbeit mit vier verschiedenen Ansätzen zur Optimierung von immuntherapeutischen Interventionen für die Behandlung von Krebserkrankungen. Es wurde gezeigt, dass funktionell kompetente tumorspezifische Gedächtnis-T-Zellen das Tumorwachstum effizient kontrollieren können und für einen anhaltenden Schutz vor einem erneuten Auftreten von Tumoren und einsetzender Metastasierung benötigt werden. Das erste Projekt befasste sich daher mit spontan induzierten, Tumorantigen-reaktiven Gedächtnis-T-Zellantworten im peripheren Blut (PB) von Melanom- und dysplastischen Nävipatienten. Unter Verwendung von IFNgamma ELISPOT-Kurzzeituntersuchungen wurden ex vivo in beiden Patientengruppen hohe Frequenzen von präexistierenden, tumor-spezifischen T-Zellantworten nachgewiesen. Als antigenpräsentierende Zellen habe ich autologe dendritische Zellen verwendet, welche aus Monozyten generiert wurden. Diese wurden mit 13 verschiedenen 50 Aminosäure-langen synthetischen Melanompolypeptiden beladen, welche von immundominanten Regionen von Tumor-assoziierten Antigenen (TAAs) abgeleitet wurden. Die resultierenden T-Zellantworten waren polyvalent und HLA-unrestringiert. Darüber hinaus umfassten die generierten Polypeptidsequenzen MHC-Klasse I und II-restringierte Epitope, welche effizient von einer Vielzahl von HLA-Molekülen präsentiert werden können und daher von CD4+ und CD8+ T-Zellen erkannt wurden. Weiterhin konnte ich zeigen, dass die lange NA17-A Peptidsequenz zur Induktion von erhöhten, NA17-A reaktiven Gedächtnis-T-Zellfrequenzen führte, wohingegen keine NA17-A spezifischen Antworten durch regulatorische T-Zellen (Treg) hervorgerufen wurden. Diese Erkenntnis könnte für zukünftige Vakzinierungsansätze von entscheidender Bedeutung sein. Nach Entfernung des nicht-metastasierten Tumors oder dysplastischen Nävus sind die TAA-reaktiven T-Zellfrequenzen stark angestiegen, wodurch gezeigt werden konnte, dass präexistierende T-Zellantworten durch das Vorhandensein der Läsionen kontrolliert werden. Des Weiteren wurden Antigen-spezifische Treg im PB nachgewiesen und bei einigen Patienten ein immunsuppressives Potenzial dieser Zellen aufgezeigt. Im Allgemeinen konnte jedoch keine wesentliche Rolle von Treg bei der Kontrolle von spontanen T-Zellantworten bei Patienten mit nicht-metastasierten Melanomen oder dysplastischen Nävi nachgewiesen werden. Basierend auf diesen Ergebnissen, ist eine tumor- oder läsionsabhängige Suppression von TAA-reaktiven Gedächtnis-T-Zellantworten, neben Treg, vermutlich auch durch andere potentielle immunsuppressive Effektoren vermittelt. Dabei spielen voraussichtlich Kombinationen von löslichen und zellulären Mediatoren eine entscheidende Rolle. Zusammenfassend zeigen diese Untersuchungen, dass die generierten langen Peptide effizient dazu verwendet werden können, um präexistierende Gedächtnis-T-Zellantworten bei Melanom- und dysplastischen Nävipatienten nachzuweisen. Darüber hinaus könnten diese polyvalenten T-Zellantworten infolge einer geeigneten Peptidvakzinierung therapeutisch reaktiviert werden. Für einen zweiten Optimierungsansatz, wurde ein humanes Melanom-Maus-Xenotransplantationsmodell etabliert, um die Wirksamkeit und biologische Relevanz von humanen T-Zell-Rezeptor-(TCR) transduzierten T-Zellen, welche spezifisch für die Antigene MDM2 oder gp100 sind, in vivo zu untersuchen. Die in T-Zellen funktionell-exprimierten TCR-Konstrukte wurden zuvor in vitro optimiert. In diesem Zusammenhang wurden zum ersten Mal zwei neuartige Strategien in vivo verfolgt, welche beabsichtigten eine Fehlpaarung von TCR-Ketten zu vermeiden, um somit möglichen Autoimmunkrankheit-verursachenden, vom zielabweichenden, „off-target“ Reaktionen vorzubeugen. Bei diesen Ansätzen handelte es sich um eine molekular veränderte TCR-alpha/beta-Struktur und ein Einzelketten-TCR-Konstrukt. Unter deren Verwendung konnte das Wachstum von humanen Melanomzellen sowohl durch die optimierten MDM2 als auch gp100 TCR-transgenen T-Zellen signifikant kontrolliert werden. Darüber hinaus überdauerten die optimierten T-Zellen in vivo und konnten in den gleichen Tieren in einer Gedächtnis-T-zellvermittelten Art und Weise das Wachstum eines sekundären Tumors kontrollieren. Weiterhin war es mir möglich zu zeigen, dass eine Kombinationsbehandlung aus adoptiven T-Zelltransfer mit TCR-genmodifizierten humanen T-Zellen und einer lokalen, niedrig dosierten Tumorbestrahlung (2 Gy) zu einer verbesserten T-Zelleinwanderung in den Tumor und einer verstärkten Tumorwachstumskontrolle führte. Diese in vivo Experimente bestätigten die Realisierbarkeit und Effizienz des angewandten TCR-Designs in Hinblick auf die Optimierung von adoptiven Krebsimmuntherapien. Im dritten Projekt der vorliegenden Arbeit, wurde ein neuer Tumorzell-vermittelter immunsuppressiver Mechanismus, welcher auf den Zelladhäsionsmolekülen CEACAM6 und L1CAM basierte, untersucht. Zunächst konnten diese Moleküle auf verschiedenen Tumorzelllinien nachgewiesen werden. Unter Verwendung von Kurzzeit IFNgamma ELISPOT- und 51Cr Zytotoxizitätsexperimenten konnte anschließend gezeigt werden, dass ihre spezifische Blockade in erhöhten funktionellen Effektor-T-Zellantworten resultierte. Infolgedessen, um die Intensität von T-Zellantworten gegen maligne Tumorzellen, welche sich einer Immunerkennung entzogen haben, zu stärken, könnten CEACAM6 und L1CAM attraktive Ziele für neue immuntherapeutische Interventionen darstellen. Um die Kapazität von onkolytischen Virustherapien zu erhöhen, optimierte ich in einem vierten Projekt den viralen Transport des Newcastle Disease Virus (NDV) zu humanen Tumorzellen. In diesem Ansatz wurde zum ersten Mal in einer in vitro Kokultur die Beladung von humanen T-Zellen mit NDV untersucht. Nachfolgend konnte in einem als „hitchhiking“ definierten Transportmechanismus gezeigt werden, dass T-Zellen in der Lage sind zelloberflächengebundenes NDV an MCF-7 Tumorzellen zu übertragen. Darüber hinaus wurden Tumorzellmonolayer effizient durch aktivierte T-Zellen, welche mit einem onkolytischen NDV Stamm modifiziert wurden, zerstört. Basierend auf dieser Kombinationstherapie könnten Effektor-T-Zellen als effiziente „Transportsysteme“ eingesetzt werden, um NDV zu Tumorzellen zu transportieren, um so eine gezielte Zerstörung von Tumoren einzuleiten. Zusammenfassend zeigen die Untersuchungen der vier unterschiedlichen Ansätze, die in dieser Arbeit vorgestellt wurden, neue Perspektiven für die Optimierung zukünftiger immuntherapeutischer Interventionen, um protektive T-Zellantworten gegen klinisch-erkennbare maligne Tumore auszulösen und zusätzlich zu unterstützen.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Beckhove, Prof. Dr. Philipp
Date of thesis defense: 25 October 2011
Date Deposited: 11 Jan 2012 11:54
Date: 2011
Faculties / Institutes: Service facilities > German Cancer Research Center (DKFZ)
Subjects: 570 Life sciences
Uncontrolled Keywords: memory T cells , T cell receptor , regulatory T cells , immunotherapy , dysplastic nevus , malignant melanoma
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