English Title: Intracellular channeling of fatty acids by acyl-CoA synthetases

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Abstract

Acyl-CoA-Synthetasen sind essentielle Enzyme des Lipidstoffwechsels, welche Fettsäuren durch Thioesterifizierung mit Coenzym A aktivieren und sie somit für den nachfolgenden Stoffwechsel verfügbar machen. Säugetiere besitzen 13 Acyl-CoA-Synthetasen mit einer Spezifität für langkettige Fettsäuren, von denen mehrere Enzyme simultan auf unterschiedlichen subzellulären Organellen exprimiert werden. Basierend auf der funktionellen Redundanz aller Acyl-CoA-Synthetasen bei Vorliegen unterschiedlicher subzellulärer Lokalisierungen wurde die Kanalisierungshypothese formuliert. Diese postuliert, dass die Lokalisierung der Acyl-CoA-Synthetasen auf unterschiedlichen subzellulären Organellen die metabolische Richtung der aktivierten Fettsäure beeinflusst. Auch die unterschiedlichen gewebespezifische Expressionen, Substratspezifitäten und Regulationen lassen spezielle Funktionen der einzelnen Enzyme vermuten. Durch Überexpression der Acyl-CoA-Synthetasen FATP4 und ACSL4 im Zellkultursystem wurde diese Hypothese unter Anwendung von biochemischen Methoden, insbesondere der Dünnschichtchromatographie, untersucht. Drei verschieden lokalisierte ACSL4-Proteine wurden verwendet, die sich durch unterschiedliche N-Termini auszeichneten, welche die Enzymaktivität nicht beeinflussten. In diesem System wurden die Auswirkungen der unterschiedlichen Lokalisierung desselben Enzyms auf den Lipidmetabolismus der aktivierten Fettsäure untersucht. Die Überexpression von FATP4 und ACSL4 steigerte die Fettsäureaufnahme. Für FATP4 wurde in C2C12- und HEK293-Zellen gezeigt, dass markiertes exogenes Oleat bereits innerhalb von Minuten in Triacylglycerin gespeichert wurde. Diese Stoffwechselrichtung zeigte sich auch nach drei Stunden, so dass die Menge markierter Neutrallipide in den FATP4.HEK293 auf das 3,2-fache stieg während die Menge der Phospholipide nur auf das 1,3-fache stieg. Verglichen dazu konnte nach Überexpression der ACSL4-Proteine in COS-Zellen gezeigt werden, dass zusätzlich aufgenommenes Arachidonat in bestimmten Phospholipiden gebunden wurde, so dass die Anteile des Phosphatidylcholins sowie des Phosphatidylinositols um bis zu 50 % anstiegen. Die unterschiedliche Metabolisierung von durch FATP4 und ACSL4 aktivierten Fettsäuren zeigt, dass die Art der Acyl-CoA-Synthetase die Richtung des Stoffwechsels der aufgenommenen Fettsäure beeinflusst. Nach Überexpression der ACSL4-Proteine auf unterschiedlichen subzellulären Organellen wurden lokalisierungsspezifische Effekte beobachtet. So wurde die Inkorporierung von aktiviertem Arachidonat in Phosphatidylcholin durch das ACSL4 der Plasmamembran und des Cytosols gegenüber dem ER-ständigen M-ACSL4 und dem Mito-ACSL4 am stärksten erhöht, während ACSL4 die Fettsäureoxidation nicht steigern konnte. M-ACSL4 und Mito-ACSL4 hingegen steigerten die Arachidonatoxidation um 58 % und 40 %. In M-ACSL4 überexprimierenden Zellen war ein um mehr als 30 % erhöhter Phosphatidylinositolanteil gegenüber Mito-ACSL4 überexprimierenden Zellen auffällig. Folglich scheint das ER-ständige M-ACSL4 gezielt Arachidonat für die Synthese von Phosphatidylinositol zu aktivieren. Zusätzlich wurden in M-ACSL4 überexprimierenden Zellen ein erhöhter Anteil an Diacylglycerin und ein verminderter Anteil an Cholesterinestern gegenüber Mito-ACSL4 überexprimierenden Zellen nachgewiesen. Die erhöhten Anteile an Phosphatidylinositol und Phosphatidylcholin deuten auf eine Speicherung von Arachidonat in diesen Lipiden hin. Durch die Aktivität der Phospholipase A2 kann Arachidonat freigesetzt und für die Synthese proinflammatorischer Eicosanoide verwendet werden. Der auffällig höhere Phosphatidylinositolanteil in M-ACSL4 gegenüber Mito-ACSL4 exprimierenden Zellen könnte zudem auf eine spezielle Funktion von Phosphatidylinositol in den neuronalen Geweben hindeuten, in welchen M-ACSL4 nativ exprimiert wird. Als ursächlich für die erhöhten Anteile der Cholesterinester in den Mito-ACSL4 überexprimierenden Zellen gegenüber den M-ACSL4 überexprimierenden Zellen wird die Lokalisierung der Acyl-CoA:Cholesterin-Acyltransferase in der Mitochondrien-assoziierten Membran angenommen. Durch die räumliche Nähe von Mitochondrien und Endoplasmatischem Retikulum kann das durch Mito-ACSL4 aktivierte Arachidonat für die Synthese von Cholesterinestern verwendet werden. Abschließend wurde die unterschiedliche Inkorporierung verschiedener exogener markierter Fettsäuren, des Acetats und der daraus de novo synthetisierten Fettsäuren in die zellulären Lipide gezeigt. So wurden nach Inkubation der Zellen mit markiertem Acetat bis zu 20 % mehr markierte Phospholipide gebildet als nach Markierung der Zellen mit Fettsäuren. Markiertes Oleat wurde gegenüber Arachidonat vermehrt zu Phosphatidylcholin und weniger zu Triacylglycerin umgesetzt. Die Ergebnisse zeigen, dass die Richtung des Fettsäurestoffwechsels von der Art der verwendeten Fettsäure, von der spezifischen Acyl-CoA-Synthetase und deren Lokalisierung beeinflusst wird.

Translation of abstract (English)

Acyl-CoA synthetases are essential housekeeping enzymes which activate fatty acids by thioesterification with coenzyme A thus making them available to downstream metabolic pathways. 13 mammalian long chain acyl-CoA synthetases have been identified which are expressed simultaneously on different subcellular organelles. Based on the functional redundancy of all acyl-CoA synthetases and their different subcellular localisation the channeling hypothesis was developed. The hypothesis proposes the localisation of acyl-CoA synthetases to distinct subcellular organelles to influence the metabolic fate of activated fatty acids. Additionally, the tissue-specific expression pattern as well as the distinct substrate specificity and enzyme regulation indicate special functions for the various enzymes. By overexpressing the acyl-CoA synthetases FATP4 and ACSL4 in mammalian cell culture the channeling hypothesis was analysed using biochemical methods, especially thin layer chromatography. The effect of a differential localisation of the same acyl-CoA synthetase on the metabolism of the activated fatty acid was analysed by use of three differently localised ACSL4 proteins containing distinct N-termini which did not influence the enzymatic activity. Overexpression of FATP4 and ACSL4 enhanced fatty acids uptake. In C2C12 cells and HEK293 cells that overexpressed FATP4 labelled exogenous oleate was metabolised to triacylglycerol within minutes. This metabolic fate was also shown after three hours of labelling and resulted in a 3.2-fold increase in labelled neutrallipid amounts in contrast to the amounts of phospholipids which increased only 1.3-fold. In comparison overexpression of ACSL4 proteins in COS cells resulted in the incorporation of arachidonate into special phospholipids. As a consequence of this, the intracellular amount of labelled phosphatidylcholine and phosphatidylinositole increased up to 50 %. The differential metabolism of fatty acids activated by either FATP4 or ACSL4 demonstrates that their metabolic fate is influenced by the type of acyl-CoA synthetase activating the fatty acid. Following overexpression of ACSL4 proteins on distinct subcellular organelles some localisation specific effects were detected. Thus, the incorporation of activated arachidonate into phosphatidylcholine was more increased by overexpression of plasmamembrane bound and cytosolic ACSL4 than by overexpression of ER-localised M-ACSL4 or Mito-ACSL4, whereas fatty acid oxidation was not changed. M-ACSL4 or Mito-ACSL4 increased oxidation by 58 % and 40 %, respectively. In M-ACSL4 overexpressing cells the relative amount of labelled phosphatidylinositole was increased by more than 30 % compared to Mito-ACSL4 overexpressing cells. Thus, the M-ACSL4 on the endoplasmic reticulum seems to activate arachidonate destined for the synthesis of phosphatidylinositole. In addition, M-ACSL4 overexpressing cells contained an increased relative amount of diacylglycerol and a decreased relative amount of cholesterolester compared to Mito-ACSL4 overexpressing cells. The increased amounts of phosphatidylcholine and phosphatidylinositole indicate that these lipids store arachidonate. The phospholipase A2 releases arachidonate which can be used for the synthesis of proinflammatory eicosanoids. The higher amount of phosphatidylinositole in M-ACSL4 compared to Mito-ACSL4 overexpressing cells may reveal a specific function of phosphatidylinositole in neuronal tissues, which express M-ACSL4 natively. It is assumed that the increased amounts of cholesterolester in Mito-ACSL4 versus M-ACSL4 overexpressing cells may be caused by acyl-CoA:cholesterol-acyltransferase which is localised to the mitochondrial-associated membrane. Due to the spatial proximity of mitochondria and endoplasmic reticulum the arachidonate activated by Mito-ACSL4 is used for the esterification of cholesterol. The differential incorporation of exogenous fatty acids, acetate and the de novo synthesised fatty acids into cellular lipids was shown. Thus, the incorporation of acetate into labelled phospholipids was increased up to 20 % compared to the incorporation of fatty acids. In comparison to arachidonate, more oleate was incorporated into phosphatidylcholine and less into triacylglycerol. In conclusion, the results show that the direction of fatty acid metabolism is influenced by the fatty acid analysed, the specific acyl-CoA synthetase and its subcellular localisation.