English Title: The Quantification of the Genotoxicity of Self-Inactivating Retroviral Vectors for Gene Therapy

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Abstract

Die retrovirale Gentherapie wurde bereits in mehreren klinischen Studien erfolgreich zur Behandlung monogenetischer Erkrankungen eingesetzt. Die vektorassoziierte Aktivierung zellulärer Protoonkogene (z.B. MDS1/EVI1) und die Manifestation maligner Transformation in einzelnen Patienten verdeutlichten jedoch das Risiko, das mit dem Einsatz integrierender Vektorsysteme verbunden ist. Neben der Protoonkogen-Aktivierung existieren noch weitere vektorassoziierte Ereignisse mit potentiell toxischen Auswirkungen (z.B. Haploinsuffizienz, Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen, aberrante Transkripte und veränderte Proteine). Ein genaues Verständnis der unterschiedlichen Aspekte der Genotoxizität gentherapeutischer retroviraler Vektoren ist daher von größter Wichtigkeit für deren klinische Anwendung. In dieser Arbeit wurden sicherheitsrelevante Parameter der Funktion SIN-retroviraler Vektoren für die Gentherapie der Septischen Granulomatose (X-CGD) systematisch quantifiziert. Vergleichende Integromanalysen wurden verwendet, um ein Aktivitätsprofil genetischer Nebenwirkungen in vitro und im präklinischen Mausmodell zu erheben. Die Vektoren verursachten keine vektorvermittelte klonale Selektion und wiesen eine signifikant geringere Inzidenz von Integraten im MDS1/EVI1 Lokus auf als die herkömmlichen Vektoren mit vollständigen ‚Long Terminal Repeats‘ (LTR). Die Untersuchung viral-zellulärer Spleißprodukte mit einem gammaretroviralen SIN-Vektor zeigte nur vereinzelte aberrante Fusionstranskripte. Klonalitätsanalysen der frühen Hämatopoese nach klinischer SIN-lentiviraler Gentherapie (University College London) zeigten eine polyklonale genkorrigierte Repopulation, wobei die unzureichende Konditionierung des Patienten nach 6 Monaten zum Verlust der Genmarkierung führte. Im Gegensatz zu bisherigen X-CGD Gentherapiestudien fand hier keine bevorzugte Integration in den Genlokus MDS1/EVI1 statt. Somit konnte gezeigt werden, dass der genetische Hintergrund der X-CGD keinen offensichtlichen Einfluss auf die präferentielle Integration in diesen Lokus oder andere ausübt. In primären hämatopoetischen Zellen und in einem Genotoxizitätsassay mit einer IL-3 abhängigen Zelllinie wurden die Auswirkungen verschiedener lentiviraler Vektoren untersucht. Die Art und Aktivität des internen Promotors in SIN-lentiviralen Vektoren bestimmt maßgeblich das Integrationsprofil sowie die Bildung chimärer Transkripte. Es wurde gezeigt, dass der interne Promotor die Restaktivität des 5’-SIN-LTRs und somit das Risiko zur Bildung viral-zellulärer Fusionstranskripte unter Beteiligung des kanonischen Spleißdonors erhöht. Mit einem schwachen Promotor sinkt hingegen die Wahrscheinlichkeit zur Ausbildung aberranter Transkripte. Durch den Genotoxizitätsassay wurde die Bedeutung der Inzidenz viral-zellulärer Fusionstranskripte für das genotoxische Potential lentiviraler Vektoren bestätigt. Die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse zeigen, dass durch hochauflösende funktionelle Integromanalysen eine fundierte Einschätzung der biologischen Sicherheit gentherapeutischer retroviraler Vektoren möglich ist. Der Einfluss neuer struktureller Vektorelemente auf das Sicherheitsprofil wurde definiert und dessen biologische Relevanz anhand der generierten Transkripte und in angeschlossenen Genotoxizitätsassays bestimmt. Detaillierte präklinische Analysen gammaretro- und lentiviraler SIN-Vektoren ermöglichten den Nachweis der sicheren und effizienten retroviralen X-CGD Gentherapie und deren Translation in die Klinik. Ein sicherheitsoptimierter SIN-gammaretroviraler Vektor wurde für eine klinische Phase I/II X-CGD Studie zugelassen.

Translation of abstract (English)

Retroviral gene therapy was successfully applied in several clinical trials for the treatment of monogenic diseases. However, vector-associated activation of cellular proto-oncogenes (e.g. MDS1/EVI1) and manifestation of malignant transformation in individual patients illustrated the risk that is associated with the use of integrating vector systems. Apart from proto-oncogene activation further vector-associated effects with potential toxic consequences exist (e.g. haploinsufficiency, inactivation of tumor suppressor genes, aberrant transcripts or altered proteins). Thus, a profound understanding of the different aspects contributing to the genotoxic potential of gene therapeutic vectors is essential for their clinical application. In this study safety-relevant parameters of the function of SIN-retroviral vectors for the gene therapy of X-linked chronic granulomatous disease (X-CGD) were systematically quantified. Comparative integrome analyses were used to establish an activity profile of genetic side effects in vitro and in preclinical mouse models. These vectors did not trigger vector-associated clonal selection and displayed a significantly reduced incidence of insertions in the MDS1/EVI1 locus compared to conventional vectors with complete long terminal repeats (LTR). The dissection of viral-cellular fusion transcripts caused by a gammaretroviral SIN-vector revealed only rare aberrant fusion transcripts. Clonality analyses of early hematopoiesis after SIN-lentiviral X-CGD gene therapy (University College London) showed a polyclonal gene-corrected repopulation, which was lost about 6 months later probably due to an insufficient conditioning before transplantation. In contrast to previous X-CGD gene therapy studies no preferred integration in the MDS1/EVI1 gene locus was observed. Thus, the genetic background of X-CGD does not exert an obvious effect on the preferential integration in this or other loci. In primary hematopoietic cells and in a genotoxicity assay with an IL-3-dependent cell line the effects of various lentiviral vectors were examined. The nature and strength of the internal promoter in SIN-lentiviral vectors is decisive for the integration site profile and the formation of chimeric transcripts. It was shown that the internal promoter affects the residual activity of the 5’-SIN-LTR, thereby potentially increasing the risk of viral-cellular fusion transcript formation by an elevated usage of the strong canonical splice donor. However, with a weak promoter the influence on aberrant transcript formation decreases. Using the genotoxicity assay the importance of the incidence of viral-cellular fusion transcripts for the genotoxic potential of lentiviral vectors was confirmed. The results presented here demonstrate the feasibility of high-resolution functional integrome analyses for the sophisticated assessment of the biological safety of therapeutic retroviral vectors. The impact of new structural vector elements on the vector safety profile was defined and its biological relevance determined by the generated transcripts and in associated genotoxicity assays. Detailed preclinical analyses of gammaretro- and lentiviral SIN-vectors confirmed their potential as safe and efficient tools for the gene therapy of X-CGD and enabled the translation into the clinics. These analyses facilitated the approval of a safety-optimized SIN-gammaretroviral vector for a clinical phase I/II X-CGD gene therapy trial.