German Title: Flavinaufnahme und -stoffwechsel in Listeria monocytogenes und FMN Riboswitches als Zielstrukturen für Flavinanaloga

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Abstract

The riboflavin analog roseoflavin – an antibiotic produced by the bacteria Streptomyces davawensis and Streptomyces cinnabarinus, and the key intermediate of the roseoflavin biosynthesis, 8-demthyl-8-amino riboflavin which is an antibiotic as well, are both known to have a growth inhibiting effect on the human pathogen Listeria monocytogens. The adverse effect of roseoflavin on L. monocytogenes has been proposed to be a result of its interaction with the FMN riboswitch Rli96, regulating expression of the riboflavin transporter gene lmo1945. Whether flavin analogs, such as roseoflavin and 8-demethyl-8-amino riboflavin, are assimilated by L. monocytogenes through the riboflavin transporter protein Lmo1945 has not yet been known. In addition, the conversion of flavin analogs into cofactor analogs by flavokinase/FAD synthetase enzymes from L. monocytogenes has not been investigated. The functional analysis of the effect of the cofactor analogs on the FMN riboswitch Rli96 could help to elucidate how flavin analogs affect riboflavin auxotrophic bacteria, including L. monocytogenes. Through heterologous expression of Lmo1945 in a riboflavin transporter deficient Bacillus subtilis strain, the role of Lmo1945 in the uptake of riboflavin and roseoflavin was confirmed. Two enzymes, catalyzing the conversion of riboflavin into the cofactors flavin mononucleotide (FMN) and flavin adenine dinucleotide (FAD) have been identified by sequence analysis. The bifunctional flavokinase/FAD synthetase Lmo1329 and the unique monofunctional FAD synthetase Lmo0728 were purified and kinetically characterized. Additionally, their involvement in the generation of the cofactor analogs roseoflavin mononucleotide (RoFMN), 8-demethyl-8-amino riboflavin mononucleotide (AFMN), roseoflavin adenine dinucleotide (RoFAD) and 8-demethyl-8-amino riboflavin adenine dinucleotide (AFAD) were shown in vitro. Notably, the bifunctional enzyme Lmo1329 did not convert the roseoflavin derived cofactor RoFMN into RoFAD. In vivo reporter gene assays and in vitro transcription/translation experiments showed that the FMN riboswitch Rli96, and consequently the expression of the riboflavin transporter gene lmo1945, is negatively affected by FMN and RoFMN but not by AFMN. With the FMN riboswitch Rli96, the riboflavin transporter Lmo1945, the bifunctional flavokinase/FAD synthetase Lmo1329 and the monofunctional FAD synthetase Lmo0728, the key mechanisms of riboflavin uptake and metabolism in L. monocytogenes were identified and characterized. Particularly, the FAD synthetase Lmo0728 is the first monofunctional FAD synthetase that has been described in bacteria. As a second part of this thesis a novel reporter system for in vivo studies of translational riboswitches in Streptomyces species was evaluated. However, the system proved to not be suitable for the desired application, i.e. the confirmation of previously obtained in vitro data. Several attempts to adapt and optimize the system failed which turned out to be due to the complexity of the natural expression platform in streptomycetes.

Translation of abstract (German)

Von dem Riboflavinanalogon Roseoflavin – einem Antibiotikum das von den Bakterien Streptomyces davawensis und Streptomyces cinnabarinus produziert wird sowie von 8-Demethyl-8-Amino-Riboflavin, einem wichtigen Zwischenprodukt der Roseoflavinbiosynthese, ist bekannt, dass sie auf das humanpathogene Bakterium Listeria monocytogenes eine wachstumshemmende Wirkung haben. Die hemmende Wirkung von Roseoflavin auf L. monocytogenes wurde seinem Einfluss auf den FMN Riboswitch Rli96, der die Expression des Riboflavintransportergens lmo1945 reguliert, zugeschrieben. Ob auch Flavinanaloga, wie Roseoflavin und 8-Demethyl-8-Amino-Riboflavin, von L. monocytogenes mittels des Riboflavintransporters Lmo1945 aufgenommen werden, war bislang nicht bekannt. Auch die Umsetzung von Flavinanaloga zu Cofaktoranaloga durch Flavokinasen/FAD synthetasen in L. monocytogenes wurde bisher noch nicht untersucht. Die funktionelle Charakterisiereng der Interaktion zwischen Cofaktoranaloga und dem FMN Riboswitch Rli96 könnte dazu beitragen, den Einfluss von Flavinanaloga auf riboflavinauxotrophe Bakterien wie L. monocytogenes besser zu verstehen. Durch die heterologe Expression von Lmo1945 in einem spezialisierten Bacillus subtilis Stamm konnte die Rolle von Lmo1945 als funktioneller Transporter für Riboflavin und Roseoflavin bestätigt werden. Zwei Enzyme, die die Umsetzung von Riboflavin in die Cofaktoren Flavinmononukleotid (FMN) und Flavin-Adenin-Dinukleotid (FAD) katalysieren, konnten durch Sequenzvergleiche identifiziert werden. Die bifunktionelle Flavokinase/FAD synthetase Lmo1329 und die monofunktionelle FAD synthetase Lmo0728 wurden aufgereiningt und anschließend bezüglich ihrer kinetischen Eigenschaften charakterisiert. Weiterhin konnte ihre Rolle in der Biosynthese der Cofaktoranaloga Roseoflavinmononukleotid (RoFMN), 8-Demethyl-8-Amino-Riboflavinmononukleotid (AFMN), Roseoflavin-Adenin-Dinkleotid (RoFAD) und 8-Demethyl-8-Amino-Riboflavin-Adenin-Dinukleotid (AFAD) durch in vitro Experimente aufgezeigt werden. Bemerkenswert war, dass die bifunktionelle Flavokinase/FAD synthetase Lmo1329 RoFMN nicht in RoFAD umsetzt. Mittels eines in vivo Reportersystems und gekoppelten in vitro Transkriptions/Translationsexperimenten konnte gezeigt werden, dass der FMN Riboswitch Rli96, und infolgedessen auch die Expression des Riboflavintransportergens lmo1945 von FMN und RoFMN, jedoch nicht von AFMN beeinträchtigt wurde. Somit konnten mit dem FMN Riboswitch Rli96, dem Riboflavintransporter Lmo1945, der bifunktionellen Flavokinase/FAD synthetase Lmo1329 und der monofunktionellen FAD synthetase Lmo0728 die zentralen Mechanismen im Riboflavinstoffwechsel von L. monocytogenes aufgezeigt und charakterisiert werden. Besonderes Augenmerk fällt dabei auf die FAD synthetase Lm0728, die als erste bakterielle monofunktionelle FAD synthetase beschrieben wurde. In einem zweiten Teil dieser Arbeit wurde ein neuartiges Reportersystem für die in vivo Charakterisierung von translationalen Riboswitches in Streptomyceten evaluiert. Jedoch stellte sich das System für die gewünschte Anwendung, der Verifizierung von vorherigen in vitro Experimenten, als ungeeignet heraus. Mehrere Optimierungsund Anpassungsversuche blieben aufgrund der natürlichen Komplexität der Expressionsplattform in Streptomyceten erfolglos.