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Abstract

Die Kenntnis der spezifischen Aufgaben des α5β1- und des αvβ3-Integrins ist entscheidend für Studien der Zelladhäsion, des Zellspreitens sowie der Zellmigration. Solche Prozesse spielen eine große Rolle bei vielen pathologischen und physiologischen Vorgängen wie der Metastasenbildung, der embryonalen Entwicklung oder der Wundheilung. Bislang bleibt die Aufklärung der Funktion einzelner Integrine während dieser Prozesse aufgrund fehlender spezifischer Molekülwerkzeuge, die jedes einzelne Integrin selektiv ansprechen, eine Herausforderung. Erst vor einiger Zeit wurden selektive Liganden entwickelt, die im Stande sind einzelne Integrine zu erkennen. Im Fokus dieser Arbeit stand ein biomimetisches System, welches die Untersuchung der bestimmten Funktionen der Integrine α5β1 und αvβ3 ermöglichte. Dazu wurden hochselektive integrinspezifische Mimetika auf Goldnanopartikeln immobilisiert und als Imitation der extrazellulären Matrix den Zellen geboten. Die Adhäsion der menschlichen Osteosarkomazellen U2OS, die beide Integrintypen exprimieren, wurde auf drei verschiedenen Goldnanopartikeln von 30, 60 und 90 nm für beide Mimetika untersucht. Dazu wurde die projizierte Adhäsionsfläche für alle Abstände ausgemessen und quantifiziert. Ein signifikanter Unterschied wurde nicht nur zwischen der maximalen Zellfläche sondern auch in der Progression der Zellfläche mit der Zeit festgestellt. Mit zunehmenden Abstand der Goldnanopartikel nahm die maximale Zellfläche für beide Liganden ab. Jedoch zeigte sich auf dem α5β1-Mimetikum eine höhere maximale Zellfläche im Vergleich zum αvβ3-Mimetikum. Weiterhin wurde mittels kinetischer Untersuchungen ein Unterschied in der Spreitgeschwindigkeit festgestellt. Auf dem α5β1-Substrat konnten U2OS- Zellen sich immer schneller verankern und zusätzlich war der Anstieg der Zellfläche mit der Zeit deutlich rascher als auf dem αvβ3-Substrat. Die schnellere Zellflächenprogression auf dem α5β1-Mimetikum wurde für alle drei Abstände festgestellt, je größer die Abstände jedoch wurden, desto kleiner fiel der Unterschied zwischen beiden Mimetika aus. Die Analyse der Clustergröße unterschiedlicher Adhäsionsproteine zeigte ebenfalls Unterschiede zwischen der α5β1-Integrin und der αvβ3-Integrin vermittelten Zelladhäsion, die zusätzlich von der Ligandendichte des Substrats abhängt. Es wurden Cluster der Adhäsionsproteine Vinculin und phospho-Paxillin auf unterschiedlichen Goldnanopartikelabständen für beide Mimetika zur quantitativen Auswertung herangezogen. Vinculincluster besaßen auf dem αvβ3-Mimetikum eine größere Fläche im Vergleich zum α5β1- Mimetikum für alle drei Abstände. Für 30 und 60 nm unterschied sich die Fläche signifikant. Für 90 nm war die Clusterfläche auf dem αvβ3-Substrat nur leicht erhöht. Die Phosphorylierung des Paxillins wird für beide Integrinmimetika durch die Ligandendichte auf dem Substrat dirigiert. Auf dem αvβ3-Substrat wurde für die Tyrosinphosphorylierung des Paxillins ein signifikanter Unterschied zwischen den Abständen 30 und 90, sowie 60 und 90 nm festgestellt. Im Gegensatz dazu ergab sich für das α5β1-Mimetikum ein signifikanter Unterschied beim Übergang von 60 auf 90 und von 30 auf 60 nm. Bei der immunozytochemischen Untersuchung der Integrine wurde auf dem α5β1-Substrat sowohl das α5β1-Integrin als auch das αvβ3-Integrin nachgewiesen. Auf dem αvβ3-Substrat befanden sich ausschließlich αvβ3-Integrincluster. Die Anwesenheit der beiden Integrintypen auf dem α5β1-Substrat ist höchstwahrscheinlich auf einen Rho-GTPasen-abhängigen Crosstalk zwischen den beiden Integrinen zurückzuführen. Bei Inhibierung des αvβ3-Integrins mittels thiolfreien Mimetikums wurde die Zelladhäsion auf dem αvβ3-Substrat blockiert, während auf dem α5β1-Substrat die Adhäsion weiterhin ungehindert stattfand. Dagegen wurde bei Inhibierung des α5β1-Integrins die Zelladhäsion auf dem α5β1-Substrat verhindert und auf dem αvβ3-Substrat erfolgte diese einwandfrei. Bei der immunozytochemischen Integrinfärbung nach der Inhibierung wurde nun auf dem α5β1-Substrat ausschließlich das α5β1-Integrin mit fibrillären Strukturen festgestellt, die vorzugsweise im Zellzentrum lokalisiert sind. Auf dem αvβ3-Substrat wurden dagegen nur αvβ3-Integrincluster detektiert. Demzufolge führt die Blockierung des αvβ3-Integrins zwar nicht zu einer Verhinderung der Zelladhäsion, jedoch wird die Ausbildung von stabilen α5β1-Integrinclustern unterbunden. Resultierend aus den experimentellen Beobachtungen lassen sich deutliche Funktionsunterschiede zwischen dem Integrin α5β1 und dem Integrin αvβ3 schlussfolgern. So scheint das α5β1-Integrin eher eine größere Rolle bei der anfänglichen Zellanhaftung an das Substrat zu spielen, während das αvβ3- Integrin für die Ausbildung stabiler Fokaladhäsionen verantwortlich ist.