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Abstract

Cancer is one of the leading causes of mortality worldwide. An important hallmark of cancer is its ability to escape immune surveillance by developing several immunological obstacles. These include a plethora of mechanisms that either dampen immune cell functionality, or foster tumor cell resistance towards immune attack. Immunotherapeutic strategies, such as immune checkpoint blockade, have emerged as promising therapeutic approaches for cancer treatment. However the majority of tumor patients are refractory to current immune therapeutic tools, emphasizing the need to identify more key players that could radically improve immunotherapy. This study aimed to systematically identify novel tumor-associated immune modulators by performing a high-throughput RNAi screen and subsequently validate novel candidate genes whose blockade could potentially enhance anti-tumor immune response in tumor patients. Starting from a pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) co-culture model, 2514 genes were knocked down in a luciferase-expressing tumor cell line using a siRNA library. Subsequently, the transfected tumor cells were cocultured with HLA-A2.1+- matched tumor infiltrating lymphocytes (TILs). TIL-mediated cytotoxicity was then assessed by measuring the remaining luciferase intensity of transfected tumor cells. In order to exclude genes whose knock-down affected cell viability per se, we cultivated tumor cells with the siRNA library in the absence of TILs. The primary screening revealed 155 potential candidate genes (hits) whose downregulation increased T cell-mediated tumor lysis more efficiently than PD-L1 knockdown. The hit-list generated in the primary screen was narrowed down to 108 hits after performing a secondary screen. Among these candidate genes, salt-inducible kinase 3 (SIK3) was selected for extensive validation analysis, as this protein kinase is overexpressed in tumor biopsies and its role in immune escape mechanisms has not been reported so far. SIK3 impairment in tumor cells enhanced T cell mediated killing in several co-culture models derived from different cancer entities. We showed that SIK3 sustained intrinsic tumor resistance to immune cell attack, rather than modulating T cell functionality. We observed that T cells expressed TNF-α upon coculture with tumor cells, and that this cytokine elicited tumor cell growth in SIK3- proficinent cells. On the contrary, SIK3 depletion sensitized tumor cells towards TNFPage VIII α-induced apoptosis by regulating NF-κB activation via HDAC4. To prove the translational relevance of SIK3 blockade for cancer immunotherapy, we used a small molecule compound which recapitulated the effect of SIK3 genetic depletion. Additionally, stable knockdown of SIK3 in tumor cells resulted in retardation of tumor growth after adoptive cell transfer of TILs in a xenograft mouse model. This study describes a robust method for a comprehensive identification of novel immune modulators in solid tumors. Furthermore, this work provides the rationale of SIK3 inhibition as a novel therapeutic strategy for cancer treatment.

Translation of abstract (German)

Krebs ist eine der Hauptursachen für die krankheitsbedingte Sterblichkeit weltweit. Ein wichtiges Merkmal von Krebs ist die Fähigkeit, der Immunüberwachung durch die Entwicklung mehrerer immunologischer „Hindernisse“ zu entkommen. Dazu gehören eine Vielzahl von Mechanismen, die entweder die Immunzellenfunktionalität abschwächen oder die Tumorzellresistenz gegen den Immunangriff erhöhen. Immuntherapeutische Strategien, wie die Immun-Checkpoint-Blockade, sind als vielversprechende therapeutische Ansätze für die Krebsbehandlung bekannt. Jedoch, profitiert die Mehrheit der Tumorpatienten nicht von den aktuellen immuntherapeutischen Ansätzen, was die Notwendigkeit neue wichtige immunologische „Key player“ zu identifizieren hervorbringt. Diese Studie zielte darauf ab, neuartige Tumor-assoziierte Immunmodulatoren deren Blockade die Antitumor-Immunantwort bei Tumorpatienten verstärken könnten, systematisch zu identifizieren. Hierzu wurden Kandidaten mittels eines RNAi Hochdurchsatz-Screenings ermittelt und anschließend validiert. Ausgehend von einem Adenokarzinoms des Pankreas (Bauchspeicheldrüsenkrebs) Modell wurden 2514 Gene in einer Luziferase exprimierenden Tumorzelllinie unter Verwendung einer siRNA-Bibliothek supprimiert. Anschließend wurden die transfizierten Tumorzellen mit passenden HLA-A2.1+ Tumor infiltrierenden Lymphozyten (TILs) co-kultiviert. Die TILvermittelte Zytotoxizität wurde anhand der Messung der verbleibenden Luciferase- Intensität der überlebenden Tumorzellen bewertet. Um Gene auszuschließen, deren Supprimierung die Zelllebensfähigkeit beeinflussen, wurden siRNA-transfizierte Tumorzellen in Abwesenheit von TILs kultiviert. Das primäre Screening zeigte 155 potentielle Genkandidaten (Hits), deren Knockdown die T-Zell-vermittelte Tumor-Lyse effizienter erhöhte als PD-L1. Die hieraus erzeugte Hit-Liste wurde nach einem zweiten Screening auf 108 Kandidaten eingegrenzt. Unter diesen Genkandidaten wurde „salt-inducible kinase 3“ (SIK3) für eine umfangreiche Validierungsanalyse ausgewählt, Diese Proteinkinase wird in Tumorbiopsien überexprimiert und ihre Rolle in der Abwehr einer TIL-vermittelnden Zerstörung des Tumors ist unbekannt. Eine Beeinträchtigung der SIK3 Funktionalität in Tumorzellen verstärkte die T-Zell-vermittelte Zerstörung in mehreren Co-Kulturmodellen Page X verschiedener Krebsentitäten. Wir konnten zeigen, dass SIK3 eine intrinsische Tumorresistenz gegen Immunzellenangriffe induziert, anstatt die T-Zell-Funktionalität direkt zu modulieren. Wir beobachteten, dass T-Zellen in einer Co-Kultur mit Tumorzellen TNF-α sekretieren und dass dieses Zytokin Tumorzellwachstum in SIK3- positiven Zellen hervorrufen kann. SIK3 Knockdown sensibilisierte die Tumorzellen gegenüber TNF-α induzierter Apoptose durch eine HDAC4-vermittelte NF-κBAktivierung. Um die translationale Relevanz einer SIK3-Blockade für die Krebs- Immuntherapie zu testen, inhibierten wir SIK3 mit einem niedermolekularen Inhibitor, dessen Wirkung die Ergebnisse der genetischen Assays bestätigte. Darüber hinaus führte ein stabiler Knockdown von SIK3 zu einer Verzögerung des Tumorwachstums nach adoptivem Zelltransfer von TILs in einem Xenograft-Mausmodell. Diese Studie beschreibt eine robuste Methode für eine umfassende Identifizierung von neuartigen Immunmodulatoren in soliden Tumoren. Darüber hinaus bietet diese Arbeit eine experimentelle Grundlage zur Verwendung von SIK3 Inhibierung als ein neuartiger therapeutischer Ansatz für die Krebsbehandlung.