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Investigation of the lipid environment of the mammalian transamidase complex

Roxlau, Thomas Johannes

[img] PDF, English
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Abstract

The glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchor is a lipid moiety attached to over 150 human proteins and plays a crucial role in cell surface display at the plasma membrane. The transamidase complex, consisting of the subunits PIGK/S/T/U and GPAA1, is localised to the endoplasmic reticulum (ER) and is responsible for attachment of the GPI-anchor to receiving proteins. Previously, interactions between the transamidase complex subunit GPAA1 and a sphingolipid have been shown. The aim of this thesis was to establish an experimental setup to analyse protein lipid interactions of the transamidase complex. These interactions were assessed via in-gel fluorescence and western blot quantification through click chemistry with bifunctional sphingolipids combined with transient expression of transamidase subunits. Thin layer chromatography was used to verify the metabolic status of exogenously added photoactivatable and clickable sphingosine (pacSph) at given time points. Results confirmed the previous reported interaction of GPAA1. The validity of this outcome was limited to GPAA1 only due to uncertainty with regards to the transient expression, such as affecting the stoichiometry of the transamidase complex and mislocalisation of the transiently overexpressed GPAA1. To circumvent these limitations, CRISPR/Cas9-based gene editing was performed to insert a C-terminal tag in the genomic region of GPAA1. This allowed to establish a cellular model to study sphingolipid and cholesterol interactions with the endogenous transamidase complex. Gene edited tagging of GPAA1 did not interfere with synthesis and trafficking of GPIanchor proteins to the cell surface. The analysis of the composition of the transamidase complex in this cell line by co-immunoprecipitation showed only PIGK/T/S to interact with GPAA1, but not PIGU. When styrene maleic anhydride (SMA) co-polymer was used to extract the transamidase complex and its native lipid environment, even PIGU was detected, suggesting that PIGU might be only loosely attached to the transamidase complex. Furthermore, first studies on mass spectrometric analysis of lipids extracted from an SMA-immunoprecipitation suggested that this approach allows to determine lipids in direct proximity of the transamaidase complex. Finally, GPAA1-pacSph metabolite interaction could be inhibited through the ceramide synthase inhibitor FB1, while the glucosylceramide synthase inhibitor PPMP did not interfere with the interaction. This suggested that ceramide or a metabolite upstream of this lipid is the interaction partner of GPAA1. In summary, the established cellular model verified previously published results in an endogenous setting. For the future, this model lays the foundation for quantitative determination of the lipid environment of the transamidase complex. Furthermore, this system might also provide structural information via single particle cryo-electron microscopy of affinity purified GPAA1 complexes.

Translation of abstract (German)

Der Glycosylphosphatidylinositol (GPI)-Anker ist eine Lipidmodifikation, welche an über 150 verschiedenen menschlichen Proteinen gefunden wurde und eine wichtige Rolle in der Lokalisation von Oberflächenproteinen an der Plasmamembran spielt. Der Transamidasekomplex, bestehend aus den Untereinheiten PIGK/S/T/U und GPAA1, befindet sich im Endoplasmatischen Retikulum (ER) und ist verantwortlich für das Anfügen des GPI-Ankers an entsprechende Proteine. Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung und Etablierung eines Versuchsaufbaues zur Analyse von Protein-Lipid-Interaktionen des heteropentameren Transamidasekomplexes. Basierend auf photoaktivier- und kreuzvernetzbaren Sphingolipiden und transienter Expression von Transamidasekomplexuntereinheiten wurde ein Protokoll zur Untersuchung der Sphingolipidinteraktionen des Komplexes etabliert. Dünnschichtchromatographie wurde eingesetzt um die Verstoffwechselung des exogen hinzugefügten bifunktionalen Sphingosins (pacSph) zu verfolgen. Die Ergebnisse bestätigten bereits vorhandene Ergebnisse zur Sphingolipid-Interaktion von GPAA1. Durch die transiente Expression wurden jedoch eine Beeinflussung der Stöchiometrie des Transamidasekomplexes und Fehllokalisation von GPAA1 beobachtet, welche die Aussagekraft der Ergebnisse mindert. Um diese Limitierungen zu überkommen, wurde eine CRISPR/ Cas9 Geneditierung im genomischen Lokus von GPAA1 mit dem Ziel der Insertion eines Cterminalen Tags durchgeführt. Dies führte zur Generierung einer Zelllinie, welche geeignet ist Interaktionen von Sphingolipiden und Cholesterin mit dem Transamidasekomplex zu studieren. Nach Geneditierung wurde keine Beeinflussung der Synthese oder des Transportes von GPIAnker- Proteinen an die Zelloberfläche festgestellt. Bei der Analyse der Komposition des Transamidasekomplexes durch Co-Immunpräzipitation mit GPAA1 konnten nur PIGK/T/S nachgewiesen werden, während PIGU nicht detektierbar war. PIGU konnte jedoch nachgewiesen werden, wenn mit Styrol-Maleinsäureanhydrid (SMA)-Copolymer der Transamidasekompex in seiner nativen Lipidumgebung extrahiert wurde. Dies deutet auf eine eher transiente Assoziation von PIGU mit dem Transamidasekomplex hin. Weiterhin konnten bei einer massenspektrometrischen Analyse einer SMA-Immunpräzipitation Lipide detektiert werden, welches die Möglichkeit der quantitativen Analyse der nativen Lipidumgebung des Transamidasekomplexes anhand dieser Versuchsanordnung aufzeigt. Schlussendlich konnte die GPAA1-pacSph Interaktion durch die pharmakologische Hemmung der Ceramid-Synthase gestört werden, während ein Inhibierung der Glucosylceramid-Synthase keine Auswirkungen hatte. Dies ist ein Indiz dafür, dass Ceramid oder ein im Biosyntheseweg dem Ceramid nachgeschalteter Metabolit den Interaktionspartner von GPAA1 stellt. Zusammenfassend konnten in dieser Arbeit mit dem neu etablierten Zellmodel bereits über einen alternativen Ansatz gewonnene Daten bestätigt werden. Darüber hinaus wurden die Grundlagen geschaffen, um in zukünftigen Experimenten die native Lipidumgebung zu untersuchen. Weiterhin dienen diese Vorarbeiten als Anknüpfungspunkt für weiterführende Experimente zur strukturelle Analyse des GPAA1-Komplexes durch Einzelpartikel-Kryo-Elektronenmikroskopie.

Item Type: Dissertation
Supervisor: Brügger, Prof. Dr. Britta
Date of thesis defense: 8 July 2019
Date Deposited: 25 Sep 2019 07:56
Date: 2020
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Dean's Office of the Faculty of Bio Sciences
Subjects: 570 Life sciences
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