German Title: Nachweis über die Effektivität von S/MAR Vektor generierten NY-BR-1 spezifischen CAR+ T Zellen in präklinischen Brustkrebsmodellen

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Abstract

Breast cancer is the most frequent cause of death among cancer diseases in women despite improved treatment options, which makes new and further development of additional therapeutic approaches urgently necessary. Immunotherapy, in particular CAR - based T cell therapy, became an increasingly important therapeutic tool in recent decades due to great success in the treatment of hematological diseases. However, this approach proved to be very challenging in the treatment of solid tumors due to the lack of tumor specific antigens and inefficient persistence and infiltration of CAR+ T cells into these tumors. The breast cancer antigen NY-BR-1, which is overexpressed in more than 70 % of breast cancer tumors and metastases, might serve as a target antigen for CAR - based immunotherapy. The feasibility of this hypothesis was investigated in this study using three different CAR candidates varying in their binding sites within the NY-BR-1 protein. During this process, the efficacy and safety of the individual CAR candidates was evaluated using various in vitro and in vivo experiments. At the beginning of this work, human and murine NY-BR-1 - expressing cell lines were successfully generated by lentiviral transduction. However, surface expression of the NY-BR-1 protein decreased over time, mainly due to the dependency of NY-BR-1 expression on the G1 cell cycle phase and degradation by proteasomes. For the generation of murine CAR+ T cells, a novel transfection strategy based on S/MAR DNA vectors (pS/MARter, NanoCMARter) was established. This innovative technology enabled a cost-efficient, fast and very effective generation of CAR - expressing murine T cells and was also successfully applied to human (CAR+) T cells. Indeed, all three CAR candidates, expressed in lentivirally transduced or (S/MAR vector) electroporated T cells, proved to be very effective in eliminating NY-BR-1 - expressing cell lines and primary pleural effusion cells isolated from breast cancer patients. Additional cross-reactivity analyses with the NY-BR-1.1 protein, which exhibits a high homology to NY-BR-1 and is expressed in the breast tissue and brain, revealed a high safety risk for the application of one particular CAR candidate in clinical trials. The same CAR additionally caused strongly increased blood cytokine levels in NY-BR-1tg/- mice displaying low NY-BR-1 expression levels in the organs. In C57BL/6 wild-type mice, however, all CAR candidates proved to be safe. The CAR+ T cell treatment of tumor bearing mice resulted in significantly delayed tumor growth and prolonged overall survival, but the CAR+ T cells differed in their infiltration efficiency depending on the CAR type. This work demonstrated that NY-BR-1 is an attractive target antigen for CAR - based immunotherapy in breast cancer patients. A direct comparison of the CAR candidates presented here revealed that one of these three candidates is particularly suitable for use in clinical trials due to its safety profile and high effectiveness.

Translation of abstract (German)

Brustkrebs stellt trotz verbesserter Therapiemöglichkeiten die häufigste Todesursache unter den Krebserkrankungen bei Frauen dar, was die Weiter- und Neuentwicklung zusätzlicher Therapieansätze notwendig macht. Die Immuntherapie, insbesondere die CAR+ T Zelltherapie, gewann in den letzten Jahrzehnten aufgrund der großen Erfolge bei der Behandlung hämatologischer Erkrankungen zunehmend an Bedeutung. Jedoch erwies sich dieser Ansatz bei der Behandlung von soliden Tumoren wegen mangelnder tumorspezifischer Antigene und ineffizienter Infiltration der CAR+ T Zellen in das Tumorgewebe als sehr schwierig. Das Brustkrebsantigen NY-BR-1, das in über 70 % der Brustkrebstumore und Metastasen überexprimiert wird, könnte als Zielantigen für eine CAR basierte Immuntherapie dienen. Die Umsetzbarkeit dieser Hypothese wurde in der vorliegenden Arbeit anhand drei verschiedener CAR Kandidaten, die sich in ihren Binderegionen innerhalb des NY-BR-1 Proteins unterscheiden, untersucht. Während dieses Prozesses sollte vor allem die Effektivität und Sicherheit der CARs unter Einsatz verschiedener in vitro und in vivo Versuche evaluiert werden. Zu Beginn dieser Arbeit wurden mittels lentiviraler Transduktion humane und murine NY-BR-1 exprimierende Zelllinien generiert. Die Oberflächenexpression des NY-BR-1 Proteins verringerte sich jedoch mit der Zeit, was vor allem auf einer Abhängigkeit der NY-BR-1 Expression von der G1 Zellzyklusphase und dem Abbau durch Proteasome beruhte. Für die Generierung von murinen CAR+ T Zellen wurde eine neuartige Transfektionsstrategie, die auf S/MAR DNA Vektoren (pS/MARter, NanoCMARter) basiert, etabliert. Diese Technologie ermöglichte eine kostengünstige, schnelle und effektive Generierung von murinen CAR exprimierenden T Zellen, die auch erfolgreich auf humane (CAR+) T Zellen angewandt wurde. Tatsächlich erwiesen sich alle drei CAR Kandidaten, die in lentiviral transduzierten oder (S/MAR Vektor) elektroporierten T Zellen exprimiert wurden, als sehr effektiv bei der Eliminierung von NY-BR-1 exprimierenden Zelllinien und primären Pleurazellen, die aus Brustkrebspatienten isoliert wurden. Zusätzliche Analysen zur Kreuzreakivität gegenüber des NY-BR-1.1 Proteins, das eine hohe Homologie zu NY-BR-1 aufweist und neben dem Brustgewebe auch im Gehirn exprimiert wird, offenbarten ein hohes Sicherheitsrisiko für den Einsatz eines bestimmten CAR Kandidaten in klinischen Studien. Dieser CAR führte zudem zu stark erhöhten Cytokinkonzentrationen in NY-BR-1tg/- Mäusen, die geringe NY-BR-1 Expressionslevel in den Organen aufweisen. In C57BL/6 Wildtyp Mäusen erwiesen sich jedoch alle CAR Kandidaten als sicher. Die CAR+ T Zellbehandlung von tumortragenden Mäusen führte zu einem signifikant verzögerten Tumorwachstum und einem verlängerten Gesamtüberleben, wobei sich die CAR+ T Zellen in ihrer Infiltrationseffizienz unterschieden. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigten, dass NY-BR-1 ein attraktives Zielantigen für CAR basierte Immuntherapien bei Brustkrebspatienten darstellt. Beim direkten Vergleich der hier vorgestellten CAR Kandidaten wurde ersichtlich, dass sich vor allem einer der drei Kandidaten aufgrund seines Sicherheitsprofils und hoher Effektivität für einen Einsatz in klinischen Studien eignet.