German Title: Phänotypisierung des potenziellen antagonistischen Knock-out der Chromatin-Remodeler EZH2 und CHD7 in neuralen Stammzellen und im erwachsenen Gehirn

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Abstract

CHARGE syndrome describes a combination of severe developmental defects including, among other things, a delayed or retarded mental development, sometimes combined with a variety of psychological symptoms. Especially, the molecular mechanisms behind this brain phenotype is little understood, and cannot be treated effectively up to now. This syndrome is caused by a heterozygous mutation in the Chromodomain helicase protein 7 (chd7) gene, which encodes an epigenetically active protein (CHD7) mediating nucleosome sliding, and associated with open and active chromatin (H3K27ac, Feng et al., 2017). Another epigenetically active protein fulfilling an opposite task is EZH2 (the catalytic part of the polycomb repressive complex 2 (PRC2)) which silences gene expression by methylating histon 3 lysin 27. Both EZH2 and CHD7 are expressed in overlapping brain regions, and a knock-out of the respective protein has opposing effects on neuronal branching (Feng et al., 2013 and Liu, Y.). With these hints it was hypothesized that EZH2 might counteract CHD7 deficiency and could be beneficial for the CHARGE condition. In the frame of this thesis I was able to generate and analyze a CHARGE mouse (CMVCre;CHD7+/fl) that displayed a variety of CHARGE related symptoms. Heterozygous chd7 mutant mice had a reduced body weight, were significantly more active, developed sever eye malformations with narrowed palpebral fissures, significantly smaller eye diameter, a thinner retina and inner nuclear layer, and partially completely dysfunctional eyes. Furthermore, the cerebellum of CHARGE mice showed a missing anterior lobe, and a disorganized purkinje cell layer with less primary branches. Also CHARGE mice have less neurogenesis ind the hippocampus. Following the main hypothesis a genetic rescue (CMVCre;CHD7+/fl;EZH2+/fl) could restore; body and brain size, the strong eye malformations observed under CHARGE conditions, the amount of neural stem cells in the dentate gyrus, and the cerebella purkinje cell layer. Moreover, an RNA sequencing of the cerebellum tissue revealed that the gene expression of many genes in the double knock-out was indeed rescued. Furthermore, a homozygous inducible double knock-out of chd7 and ezh2 (NesCreERT2;CHD7fl/fl;EZH2fl/fl) rescued the neural stem cell pool in comparison to a chd7 single knock-out. Finally, these findings encourage me to use a very potent EZH2 inhibitor to treat neural stem cells in vitro and in vivo, thus attempting a novel CHD7 deficient treatment.

Translation of abstract (German)

Das CHARGE Syndrom besteht aus einer Kombination schwerer Entwicklungsdefekte. Insbesondere die molekularen Hintergründe des Gehirns Phänotyps die in teilweise schweren psychischen Störungen und sogar geistigen Behinderungen resultieren können, sind wenig untersucht und können derzeit nicht behandelt werden. Diese Krankheit wird von einer heterozygoten Mutation im Chromatin DNA Helicase 7 (chd7) Gen verursacht, das ein Protein kodiert das Nukleosomen verschiebt und mit offenem, aktivem Chromatin assoziiert ist (H3K27ac) (Feng et al., 2017). Eine funktional gegenteilige Chromatinmarkierung, nämlich die einfach, zweifach und dreifach Methylierung von Histon 3 Lysin 27 wird von EZH2 umgesetzt, welches der katalytische Teil des polycomb repressive complex 2 (PRC2) ist. CHD7 und EZH2 werden in ähnlichen Hirnregionen exprimiert und es konnte gezeigt werden, dass ein knock-out des jeweiligen Proteins gegenteilige Effekte auf die Ausbildung neuronaler Dendriten hat (Feng et al., 2013 and Li, Y). All diese Hinweise führten zu der Hypothese, dass EZH2 in der Lage sein könnte einen Teil des CHD7 Phänotyps auszugleichen. Im Rahmen dieser Arbeit konnte ich eine CHARGE Maus (CMVCre;CHD7+/fl) kreuzen und analysieren, die viele CHARGE- ähnliche Symptome zeigte. Diese heterozygoten chd7 knock-out Mäuse waren signifikant kleiner und aktiver als die Kontrolltiere, sie zeigten schwerwiegende Fehlentwicklungen der Augen, die ein geringeren Augendurchmesser, einen dünnere innere Körnerschicht der Retina, sowie komplette Fehlbildungen der Augen ohne Pupille und mit geschlossenen Augenlidern beinhalten. Weiterhin zeigte das Kleinhirn einen fehlenden anterioren Lobus und eine unorganisierte Purkinjezellschicht mit reduzierter Dendritenbildung. Weiterhin konnte ich in CHARGE Mäusen signifikant weniger BrdU und Nestin positive Stammzellen im Gyrus Dentatus nachweisen. Unserer Haupthypothese folgend, generierte ich einen genetischen Rescue der CHARGE Maus (CMVCre;CHD7+/fl;EZH2+/fl), diese Mäuse hatten ein normales Gewicht, normal entwickelte Augen, ein unauffälliges Kleinhirn mit intakter Purkinjezellschicht und eine normale Menge and BrdU und Nestin positiven Stammzellen im Gyrus Dentatus. Darüber hinaus zeigte eine RNA Sequenzierung des Kleinhirngewebes, dass die Expression vieler Gene im Doppel- Knockout normalisiert waren. Außerdem konnte ein homozygoter Knockout von chd7 und ezh2 (NesCreERT2;CHD7fl/fl; EZH2fl/fl) den neuralen Stammzellpool des Gyrus Dentatus, in Vergleich zu einen chd7 Einzel-Knockout, retten. Diese Ergebnisse führten zu ersten Behandlungsversuchen CHD7 defizienter Stammzellen in vitro und in vivo mit einem sehr potenten EZH2 Inhibitor.