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Abstract

The interplay of multiple RNA binding domains (RBD) in a single RNA binding protein (RBP) to achieve RNA target specificity is far from being understood. In this thesis, a multidisciplinary study of Upstream of N-Ras (Unr) is presented. Unr is an RBP that has been predicted to contain five single-stranded RNA binding cold shock-domains (CSD). The thesis aims to unravel how Unr binds RNA targets specifically in a cellular context. Several NMR and crystal structures of multidomain constructs were determined. As a result, four non canonical CSDs in addition to the five previously known canonical CSDs were discovered. These non-canonical CSDs play a scaffolding role between the canonical domains, but do not bind RNA independently. Using NMR relaxation and small angle X-ray scattering, it could be shown that the linker between most of the canonical and non-canonical domains is rigid, leading to a restricted flexibility of the full-length protein. Different in vitro and cellular mutational studies, including a reporter gene assay and a RIP seq experiment showed that a disruption of the fixed domain arrangement has influence on RNA recognition and the protein function. Additionally, a crystal structure of a multidomain construct of Unr bound to poly-A RNA provides further information on the complexity of the multidomain RNA binding mechanism of Unr. Several non-canonical binding residues, some even in the non-canonical CSDs, contribute to cooperative RNA binding, suggesting that RNA binding of the full-length protein is likely to be of even higher complexity and plasticity. Further insights into Unr-RNA binding are provided by a full-length protein model, that describes a restricted flexibility of the protein, which might play an essential role within target specificity. To expand the studies towards Unr-ribonucleotide complexes a quantitative mass spectrometry analysis was conducted, that defined several Unr interactors. The protein-protein interaction with the top hit of this result, namely pAbP, was further characterized, which paves the way towards future structure analysis of a larger translation repressor complex, as it assembles on the 3’ UTR of the msl2 mRNA.

Translation of abstract (German)

Das Zusammenspiel von mehreren RNA-bindenden Domänen (RBD) in einem einzigen RNA bindenden Protein (RBP), welches die RNA-Sequenzspezifität erhöht, ist bei Weitem noch nicht verstanden. Im Rahmen dieser Arbeit werden Ergebnisse über das Multidomänen RBP ‚Upstream of N-Ras‘ (Unr) präsentiert, welches fünf RNA-Einzelstrang-bindende ‚cold shock‘ Domänen (CSD) besitzt. Diese Arbeit soll zum Verständnis beitragen, wie Unr an seine RNA Interaktionspartner spezifisch im zellulären Kontext bindet. Mehrere Multidomänen NMR- und Kristallstrukturen wurden gelöst, wodurch zusätzlich zu den fünf vorher bekannten CSDs vier weitere CSDs entdeckt wurden. Diese Domänen binden isoliert zwar keine RNA, haben allerdings eine stabilisierende Funktion auf die kanonischen CSDs. Durch NMR Relaxations- und Kleinwinkel-Röntgenstreuungsexperimente konnte gezeigt werden, dass der Linker zwischen den meisten kanonischen und nicht kanonischen CSDs starr ist, welches zu einer eingeschränkten Beweglichkeit des gesamten Proteins führt. Verschiedene Mutationsstudien in in vitro und Zellexperimenten, wie beispielsweise Reportergenassays oder RIP-seq Studien, konnten zeigen, dass ein Aufbrechen dieser starren Anordnung Einfluss auf die RNA Erkennung und die Proteinfunktion hat. Zusätzlich gibt eine Kristallstruktur eines Multidomänen-Unr-Konstruktes, welches eine poly A RNA Sequenz bindet, Aufschluss über die Komplexität der Interaktion von Unr mit RNA. Verschiedenste, für die CSD-abhängige RNA Erkennung, nicht-kanonische Aminosäuren, auch in der nicht-kanonischen RNA bindenden Domäne, tragen zu einer kooperativen RNA Bindung bei. Der RNA-binde Mechanismus für diesen Proteinteil weist auf eine hohe Komplexität der RNA Bindung für das gesamte Protein Unr hin. Ein Modell des gesamten Proteins, das eine beschränkte Beweglichkeit zeigt, die eventuell eine essentielle Rolle in der RNA Spezifität spielt, gibt zusätzliche Einblicke in eine potentielle Protein-RNA Bindung. Durch quantitative Massenspektrometrie wurden verschiedene Unr Proteininteraktionspartner identifiziert. Dies kann weiterhin verwendet werden um größere Unr-Ribonukleotidkomplexe zu charakterisieren. Die Protein-Protein Interaktion zwischen Unr und dem am meisten angereicherten Protein pAbP wurde weitergehend analysiert, was für zukünftige Strukturanalysen eines größeren Translationsrepressorkomplexes, wie er sich in der 3’UTR der msl2 mRNA bildet, hilfreich sein.