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Abstract

Hematopoietic stem cells (HSCs) derive from an endothelial precursor during embryonic development and undergo endothelial to hematopoietic transition (EHT). EHT is a highly dynamic process that is challenging to study in vivo and problematic to model in vitro, partly due to an inability to identify biologically relevant intermediate cell states. However, a previous study conducted in our group identified Evi2a as a crucial protein in hematopoietic specification. In this PhD thesis we aimed to investigate the role of Evi2a during hematopoietic specification. We performed differential gene expression analysis on differentiated wildtype and Evi2a KO cells to decipher differences in signaling processes and identify the downstream pathways of Evi2a. Furthermore, we developed an Evi2a KO mouse model to identify hematopoietic defects in vivo. Our results suggested that Evi2a KO delayed hematopoietic differentiation and a homozygous Evi2a KO might be embryonically lethal.

Adult hematopoietic stem cells are at the peak of the hematopoietic hierarchy and responsible for the lifelong production of all differentiated peripheral blood cells to ensure a healthy and balanced blood composition. In order to avoid DNA damages induced by e.g., stress, it is crucial for HSCs to remain in a quiescent state. Only when desired HSCs proliferate to replenish the need for blood cells. However, during severe infections, chronic inflammation, injury trauma as well as other challenging events HSCs are pushed to proliferate and to actively contribute to the increased cellular demand of differentiated blood cells. Repetitive activation of HSCs, as it happens during a lifetime, has been shown to lead to HSC attrition and in the worst case to aberrant blood production often coming along with a myeloid bias.

In this study we investigated the changes in HSC function and their ability to produce all downstream cells after repeated stimulation. HSC attrition has been extensively studied before using inflammatory agents. However, we were interested in HSC activation beyond inflammatory stimuli and used Thrombopoietin (TPO) and the clinically used TPO mimetic Romiplostim to induce HSC cycling. TPO stimulates megakaryocyte and platelet production and has been shown to be required for HSC maintenance and self-renewal divisions. However, we hypothesize that any cell division can induce DNA damages and consequently lead to loss of HSC function indicated by a decrease in reconstitution potential.

After repetitive TPO and Romiplostim treatment we observed an increase in the phenotypic long-term HSC pool. Performing competitive repopulation assays showed that no change in donor chimerism between control and treated group was detected. We could neither note loss of HSC function nor a myeloid bias that usually arises from exhausted HSCs. By using a label-retention mouse model we were able to track the proliferative history of HSCs and again, did not observe any reduced repopulation capacity between cells that cycled and cells that remained dormant during TPO treatment. Concluding, repetitive activation of HSCs using TPO did not lead to HSC exhaustion. However, transcriptome and methylome analysis will be carried out next to examine potential changes on molecular level.

Translation of abstract (German)

Hämatopoetische Stammzellen (HSZ) entstehen während der Embryonalentwicklung aus einem endothelialen Vorläufer und durchlaufen den so genannten endothelialen-zu-hämatopoetischen Übergang (EHT). Der EHT ist ein hochdynamischer Prozess, der in vivo nur schwer zu untersuchen und in vitro nur schwer zu modellieren ist. Das liegt unter anderem an der Unfähigkeit, biologisch relevante Zellzwischenzustände zu identifizieren. Eine frühere Studie aus unserer Gruppe, identifizierte jedoch Evi2a als ein entscheidendes Protein in der hämatopoetischen Spezifikation. In dieser Doktorarbeit galt es, die Rolle von Evi2a während der hämatopoetischen Spezifikation zu untersuchen. Wir führten differentielle Genexpressionsanalysen an differenzierten Wildtyp- und Evi2a KO-Zellen durch, um Unterschiede in den Signalprozessen zu entschlüsseln und die nachgeschalteten Signalwege von Evi2a zu ermitteln. Darüber hinaus entwickelten wir ein Evi2a KO-Mausmodell, um hämatopoetische Defekte in vivo zu identifizieren. Unsere Ergebnisse legten nahe, dass der Evi2a KO die hämatopoetische Differenzierung verzögert und ein homozygoter Evi2a KO embryonal letal sein könnte.

Adulte hämatopoetische Stammzellen stehen an der Spitze der hämatopoetischen Hierarchie und sind für die lebenslange Produktion aller differenzierten peripheren Blutzellen verantwortlich, damit eine gesunde und ausgewogene Blutzusammensetzung gewährleistet ist. Es ist entscheidend, dass HSZ in einem Ruhezustand verbleiben, um DNA-Schäden zu vermeiden, die durch z.B. Stress induziert werden. Nur bei Bedarf proliferieren HSZ, um die benötigte Menge an Blutzellen wieder aufzufüllen. Bei schweren Infektionen, chronischen Entzündungen, traumatischen Verletzungen und anderen einschneidenden Ereignissen werden HSZ jedoch zur Zellteilung gedrängt und tragen aktiv zum erhöhten Bedarf an differenzierten Blutzellen bei. Die wiederholte Aktivierung von HSZ, wie sie auch im Laufe des Lebens stattfindet, führt nachweislich zu einer HSZ-Erschöpfung und im schlimmsten Fall zu einer anormalen Blutbildung, die oft mit einer myeloischen Tendenz einhergeht.

In dieser Studie untersuchten wir die Veränderungen der HSZ-Funktion und der HSZ-Fähigkeit, nach wiederholter Stimulation, alle nachgeschalteten Zellen zu produzieren. Die HSZ-Erschöpfung wurde in anderen Studien ausgiebig mit Agenzien untersucht, die zu Entzündungen führen. Wir waren jedoch an der HSZ Aktivierung jenseits von Entzündungsreizen interessiert und verwendeten daraufhin Thrombopoietin (TPO) und das klinisch verabreichte TPO-Mimetikum Romiplostim, um die HSZ Zellteilung zu induzieren. Thrombopoietin stimuliert die Megakaryozyten- und Thrombozytenproduktion und ist nachweislich für die Erhaltung und selbsterneuernde Teilung der HSZ erforderlich. Wir stellen jedoch die Hypothese auf, dass jede Zellteilung DNA-Schäden induzieren kann und folglich zu einem Verlust der HSZ-Funktion führt, der durch eine Abnahme des Rekonstitutionspotenzials angezeigt wird.

Nach wiederholter TPO- und Romiplostim-Behandlung beobachteten wir eine Zunahme des phänotypischen HSZ-Vorkommens. Nach kompetitiven Repopulationstests wurde keine Veränderung des Spenderchimärismus zwischen der Kontroll- und der behandelten Gruppe festgestellt. Wir konnten weder einen Verlust der HSZ-Funktion noch eine myeloischen Tendenz feststellen, wie sie bei erschöpften HSZ auftritt. Durch die Verwendung eines Label-Retention-Mausmodells konnten wir den Teilungshintergrund der HSZ nachverfolgen. Dabei wurde wiederum keine reduzierte Repopulationskapazität zwischen Zellen, die sich teilten, und Zellen, die während der TPO-Behandlung in einem Ruhezustand verblieben, beobachtet. Abschließend lässt sich sagen, dass die wiederholte Aktivierung von HSZ mit TPO nicht zu einer Erschöpfung der HSZ führte. Jedoch werden weitere Transkriptom- und Methylomanalysen durchgeführt, um eventuelle Veränderungen auf molekularer Ebene zu untersuchen.