German Title: 4Pi-MINFLUX Lokalisationen von fluoreszenten Molekülen

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Abstract

MINFLUX has led to remarkable improvements in localization precision compared to centroid-fitting localization schemes. Yet, molecular localization precision with far fewer than 100 photons remained to be demonstrated. Previously, the localization precision and the number of detected photons were linked by an inverse square root relation. Decoupling these parameters allows for ultrafast tracking and measurements of photo-sensitive samples. An illumination scheme with two opposing objective lenses promises further improvements of the efficient use of detected photons in a MINFLUX localization. In this thesis, the MINFLUX concept was combined with a 4Pi-optics illumination scheme to explore highest axial localization precision with low photon counts. Simulations suggested that, for a given signal-background-ratio, a 4Pi-MINFLUX microscope would outperform single objective lens MINFLUX microscopes by 40 % in terms of detected photons required for molecular localization precision. Our implementation surpassed this expectation and achieved a localization precision of 1 nm with only several tens of detected photons in single molecule measurements. Detecting more than 100 photons led to an axial localization precision of one one- thousandth of the excitation wavelength, limited only by vibrations and thermal drift. The axial resolving power was demonstrated with DNA origami-based nanorulers featuring single fluorophore distances of 10 nm. These results highlight that molecular distances and dynamics on a spatial scale of 1 nm, and below, become accessible with an extremely low number of detected photons.

Translation of abstract (German)

MINFLUX erzielte bemerkenswerte Verbesserungen in der Lokalisierungspräzision im Vergleich zu Schwerpunkts anpassenden Lokalisierungsschemata. Allerdings wurde eine molekulare Lokalisierungspräzision mit weit weniger als 100 Photonen noch nicht erreicht. Bisher waren Lokalisierungspräzision und Anzahl der detektierten Photonen stets durch eine inverse Quadratwurzelbeziehung miteinander verbunden. Die Auflösung dieser Beziehung ermöglicht ultraschnelles Tracking und Messungen von lichtempfindlichen Proben. Die effiziente Nutzung detektierter Photonen in einer MINFLUX-Lokalisation kann mit einem Beleuchtungsschema, das zwei gegenüberliegende Objektivlinsen nutzt, weiter verbessert werden. In dieser Arbeit wurde das MINFLUX-Konzept mit einem 4Pi-Optik Beleuchtungsschema kombiniert, um höchste axiale Lokalisierungspräzision mit einer geringen Photonenzahl zu erzielen. Simulationen legten nahe, dass ein 4Pi-MINFLUX-Mikroskop bei einem gegebenen Signal-Hintergrund-Verhältnis 40 % weniger Photonen für eine molekulare Lokalisierungspräzision benötigt als MINFLUX-Mikroskope mit nur einer einzelnen Objektivlinse. Unsere Implementierung übertraf diese Erwartung und erreichte in Einzelmolekülmessungen eine Lokalisierungsgenauigkeit von 1 nm mit nur einigen zehn detektierten Photonen. Die Detektion von mehr als 100 Photonen erzielte eine axiale Lokalisierungspräzision von einem Tausendstel der Anregungswellenlänge. Dieser Wert war lediglich durch Vibrationen und thermischen Drift begrenzt. Das axiale Auflösungsvermögen wurde an Hand von DNA-Origami-basierten Nanolinealen demonstriert, deren einzelne Fluorophore einen Abstand von 10 nm besaßen. Diese Ergebnisse veranschaulichen, dass eine extrem geringe Anzahl an detektierter Photonen ausreicht, um molekulare Abstände und Dynamiken im Subnanometer-Bereich zu messen.