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Abstract

The overexpression of Fibroblast Growth Factor 2 (FGF2) is a well-known phenotype in a number of different cancer types. It acts as a very potent pro-angiogenic mitogen promoting tumour angiogenesis as well as plays a major role in tumour cell survival promoting chemo-resistance. An usual feature of FGF2 is the pathway by which it is exported from cells. Instead of being secreted through the classical ER/Golgi-dependent pathway, FGF2 is transported into the extracellular space by direct translocation across the plasma membrane. The underlying mechanism is based on the formation of lipidic membrane pores, a pathway that has been classified as type I unconventional protein secretion (UPS Type I). While a number of therapeutics have been developed targeting FGF2 signaling in cancer cells, the elucidation of the molecular mechanism of FGF2 secretion in the last two decades opened up unique opportunities to block the biological function of FGF2 under pathophysiological conditions. A number of cis- and trans-acting factors driving FGF2 secretion have been identified with (i) the Na/K-ATPase that recruits FGF2 at the inner plasma membrane leaflet, (ii) Tec Kinase that directly binds and phosphorylates FGF2, (iii) the membrane lipid phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate [PI(4,5)P2] that triggers FGF2 oligomerization and pore formation and (iv) cell surface heparan sulfate proteoglycans that capture and disassemble FGF2 oligomers at the outer plasma membrane leaflet as the final step of this secretory process. While the specific role of Tec Kinase remains to be established, it has been demonstrated that RNAi-mediated down-regulation of Tec Kinase inhibits unconventional secretion of FGF2. Recently, small molecule inhibitors have been identified that block both physical interactions between FGF2 and Tec Kinase and FGF2 secretion from cells. They are of special interest for treating cancer types that develop FGF2-dependent chemo-resistance towards otherwise effective drugs such as FLT3 inhibitors in acute myeloid leukemia (AML). The goal of this thesis was to improve the potency of FGF2/Tec inhibitors using a medicinal chemistry approach. Starting from the most potent compound, more than 130 analogues were synthesized. All compounds were tested in FGF2/Tec protein-protein interaction assays to determine their inhibitory potential. In total, thirteen compounds were identified with improved IC50 values compared to the original FGF2/Tec inhibitor. These compounds were further evaluated in cell-based assays determining their influence on FGF2 secretion. Amongst this set of compounds, two compounds were identified exerting a stronger secretion phenotype compared to the original FGF2/Tec inhibitor. Furthermore, through the structural design of the newly synthesized compounds, valuable insight was obtained into the structure-activity relationship (SAR) of the small molecule inhibitors described here. This information will be of high value in future studies aiming at the optimization of this class of FGF2/Tec inhibitors with the final goal of developing a potent drug candidate blocking the biological function of FGF2 under pathophysiological conditions.

Translation of abstract (German)

Die Überexpression von Fibroblast Growth Factor 2 (FGF2) ist ein in der Literatur gut bekannter Phenotyp, den man in einer großen Anzahl von verschiedenen Krebsarten findet. Neben seiner Wirkung als sehr starker Promoter der Angiogenese in Tumoren, spielt FGF2 auch ein große Rolle in der Entwicklung von Resistenzen gegen Medikamente und trägt maßgeblich zum Überleben von Krebszellen bei. Das besondere an FGF2 ist der Transportmechanismus, mit dem es aus der Zelle sekretiert wird. Während die meisten Proteine durch den konventionellen Weg über den ER/Golgi Apparat aus der Zelle transportiert werden, wird FGF2 direkt über die Zellmembran in die Extrazelluläre Matrix transportiert. FGF2 bildet toroidale Membranporen, durch die der direkte Transport aus der Zelle ohne Signalpeptid stattfindet. Diese Art des Transportmechansimus wird weithin als unkonventionelle Sekretion Typ I bezeichnet (UPS Type I). Die gängige Methode, um die Signalwirkung von FGF2 in Krebszellen zu unterdrücken, ist die Hemmung der Rezeptor-FGF2 Interaktionen. Durch die Aufklärung des genauen Sekretionsmechanismus von FGF2 in den letzten 20 Jahren, kann damit nun auch der einzigartige Transportweg als möglichen Therapieansatz verfolgt werden. Einige cis- und trans-Faktoren, die die Sekretion von FGF2 aus der Zelle vorrantreiben sind identifiziert worden: (i) die Na/K-ATPase, die FGF2 an die innere Plasmamembran rekrutiert, (ii) TecKinase die direkt mit FGF2 interagiert und dieses phosphoryliert, (iii) das Membranlipid Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat [PI(4,5)P2], das die Oligomerisierung und Porenbildung auslöst, (iv) Heparan sulfat proteoglykane an der Zelloberfläche, die FGF2 an der äußeren Plasmamembran einfangen und die gebildeten Oligomere abbauen. Während die genaue Rolle von Tec Kinase noch näher untersucht werden muss, konnte eine Korrelation zwischen der RNAi abhängigen Reduktion von Tec Kinase und einer verminderten FGF2 Sekretion beobachtet werden. Vor kurzem wurden Inhibitoren identifiziert, die sowohl die direkte Interaktion zwischen FGF2 und Tec Kinase verhindern als auch die Sekretion von FGF2 aus der Zelle reduzieren. Diese Art von Inhibitoren ist von besonderem Interesse für die Behandlungen von Krebsarten, die ein FGF2-abhängige Resistenz entwickelt haben gegen normalerweise sehr potente Medikamente wie zum Beispiel FLT3 Inhibitoren für die Behandlungen von akuter myeloische Leukämie (AML). Das Ziel dieser Arbeit war es, die Wirkung der FGF2/Tec Inhibitoren durch einen medizisch chemischen Ansatz zu verbessern. Basierend auf der Struktur des potentesten Inhibitors wurden mehr als 130 analoge Verbindungen synthestisiert. Alle Verbindungen wurden auf ihre hemmende Wirkung in einem FGF2/Tec Kinase Interaktions-Aassay getestet. Von den 130 Verbindungen wurden dreizehn identifiert, die eine bessere Hemmung zeigen als der ursprüngliche FGF2/Tec Inhibitor. Diese Verbindungen wurde als nächstes in einem zell-basierten Assay auf ihre Wirkung auf die Sekretion von FGF2 getestet. Aus den getesteten Verbindungen wurden zwei identifiziert, die einen stärkeren Sekretions-Phenotyp aufweisen als der ursprüngliche Inhibitor. Außerdem konnte durch das strukturierte Design der analogen Verbindungen, ein wertvoller Einblick in die Struktur-Aktivitäts-Eigenschaften des Inhibitors gewonnen werden. Diese Infomation ist von hohem Nutzen für die weitere Optimisierung dieser Klasse von FGF2/Tec Inhibitoren mit dem Ziel einen potenten Wirkstoff zu entwickeln, der die biologische Funktion von FGF2 unter pathophysiologischen Bedingungen hemmt.