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Abstract

Hepatitis B virus (HBV) and hepatitis delta virus (HDV) are widespread human pathogens that cause acute and chronic infections of the liver associated with inflammation, cirrhosis, and hepatocellular carcinoma. Despite the medical burden caused by HBV and HDV, therapeutic options are limited, and curative therapy is not available yet. The identification of the bile acid transporter sodium taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP) as functional receptor for both viruses has provided new opportunities to study virus and host factors involved in virus entry and maintenance of viral persistence in vitro. The present study aimed to investigate the contribution of de novo synthesised HBV core protein (HBc) to the maintenance of HBV persistence, and to generate fluorescently labelled HBV and HDV for the study of viral entry and trafficking. We engineered an infectious HBV mutant with a genome encoding a stop codon in the HBc ORF (ΔHBc HBV), which could not initiate nucleocapsid production upon infection. In vitro infection with wild-type (WT) and ΔHBc HBV resulted in comparable numbers of covalently closed circular (ccc)DNA, which is the transcriptionally active template for all viral transcripts and is the determinant factor of HBV persistence. During long-term infection in HepG2-NTCP cells, cccDNA levels, transcription of viral RNA, and secretion of viral proteins remained stable in WT and ΔHBc HBV-infected cells. These findings suggested that HBV cccDNA remained stable without requiring reimport of newly synthesised nucleocapsids in vitro. Furthermore, lack of de novo produced HBc did not affect the transcriptional activity of cccDNA. The generation of fluorescently labelled HBV and HDV has been hampered by the complex genome organisation of both viruses, structural restriction of these small virions, and the large excess of non-infectious subviral particles. For this study, the amber suppression technology was chosen as labelling strategy. This method expands the genetic code by site-specific incorporation of non-canonical amino acids (ncAA) in response to amber stop codons. Combined with click chemistry fluorophores, this is currently the smallest fluorescent tag that can be genetically encoded into proteins. Amber stop codons were inserted at 11 positions in the HBc ORF, and the incorporation of ncAA in response to these stop codons could rescue the expression of full-length HBc. Secretion of infectious HBV particles was observed after genetic encoding of N-Propargyl-L-lysine in HBc, which enabled copper-catalysed click labelling and visualisation of incoming nucleocapsids during in vitro infection. For the fluorescent labelling of HDV, we capitalised on the naturally present amber stop codon which terminates translation of the small hepatitis delta antigen (S-HDAg). During HDV replication, this amber stop codon is edited to a tryptophan codon, resulting in expression of a large HDAg (L-HDAg). Amber suppression mediated incorporation of ncAA at the amber stop could induce the production of L-HDAg with ncAA instead of tryptophan. Interestingly, the early expression of L-HDAg increased secretion and infectivity of HDV particles. L-HDAg could be labelled with a click chemistry functionalised fluorophore in transfected cells and in purified virions. This study highlights the persistence of HBV cccDNA in infected cells without requiring continuous replenishment by nucleocapsid reimport, suggesting that therapeutic targeting of capsid reimport is likely not sufficient to eliminate cccDNA. Furthermore, genetic code expansion mediated labelling of HBV and HDV provides a tool to visualise viral entry processes.

Translation of abstract (German)

Hepatitis B Virus (HBV) und Hepatitis Delta Virus (HDV) sind humane Krankheitserreger, die akute und chronische Leberinfektionen auslösen, welche zu Leberentzündung, Zirrhose und Leberzellkarzinom führen können. Trotz der gesundheitlichen Belastungen durch HBV und HDV sind Therapieoptionen limitiert, wobei bisher keine Heilung verfügbar ist. Die Entdeckung des Gallensäuretransporters Natrium Taurocholat Cotransport Polypeptid (NTCP) als Eintrittsrezeptor für beide Viren eröffnete neue Möglichkeiten, um die Rolle von Virus- und Wirtsfaktoren für den viralen Eintritt und für das Persistieren der viralen Genome zu untersuchen. Die vorliegende Studie untersucht die Bedeutsamkeit von de novo synthetisiertem HBV Core Protein (HBc) für die Erhaltung der Persistenz von HBV. Zudem war das Ziel dieser Arbeit die Entwicklung von fluoreszenzmarkierten HBV und HDV Partikeln, um den viralen Eintrittsprozess und intrazellulären Transport zu untersuchen. Wir haben eine infektiöse HBV Mutante entwickelt, die in ihrem Genom ein Stopcodon im HBc Gen enthält (ΔHBc HBV). Diese Mutante konnte nach der Infektion keine Nukleokapside produzieren. Nach in vitro Infektion mit Wildtyp (WT) und ΔHBc HBV wurden vergleichbare Mengen kovalent geschlossene zirkuläre (ccc)DNA gemessen. cccDNA ist die Vorlage für sämtliche virale Transkripte und damit zwingend notwendig für die virale Persistenz. cccDNA Werte, die Transkription viraler RNA und die Sekretion viraler Proteine blieben unverändert stabil in einer Langzeitinfektion mit WT und ΔHBc HBV in HepG2-NTCP Zellen. Die Erkenntnisse deuten an, dass HBV cccDNA auch ohne Reimport von neu synthetisierten Nukleokapsiden sehr stabil bleibt in vitro. Zudem hatte die Abwesenheit von de novo produziertem HBc keinen Einfluss auf die Transkriptionsaktivität von cccDNA. Die Entwicklung von fluoreszenzmarkiertem HBV und HDV ist erschwert durch die komplexe Organisation beider viralen Genome, durch die strukturellen Einschränkungen dieser kleinen Viren und durch den Überfluss von nicht infektiösen subviralen Partikeln. Um diese Hindernisse zu überwinden, haben wir die Amber Suppression Technologie eingesetzt. Diese Methode erweitert den genetischen Code, indem nicht-kanonische Aminosäuren (ncAA) positionsspezifisch als Antwort auf ein Amber Stopcodon eingebaut werden. Kombiniert mit Click-Chemie Fluorophoren ist das zurzeit die kleinste fluoreszierende Markierung, die genetisch in Proteinen kodiert werden kann. Wir haben 11 Amber Stopcodons in den HBc Leserahmen mutiert und den Einbau von ncAA getestet. Der Einbau von ncAA konnte die Expression von vollständigem HBc wiederherstellen. Nach dem Einbau von N-Propargyl-L-Lysin wurde die Sekretion von infektiösem HBV beobachtet. Dieses konnte mittels kupferkatalysierter Click-Chemie markiert werden und ermöglichte somit die Visualisierung von eingehenden viralen Partikeln während einer in vitro Infektion. Für die Fluoreszenzmarkierung von HDV haben wir das natürlich vorkommende Amber Stopcodon von HDV ausgenutzt, welches die Translation des kleinen Hepatitis Delta Antigens (S-HDAg) beendet. Dieses Stopcodon wird während der HDV Replikation zu einem Tryptophan Codon editiert, was dann zur Expression des grossen HDAg (L-HDAg) führt. Wenn Amber Suppression an diesem Amber Stopcodon eine ncAA einbaut, führt dies zur Produktion von L-HDAg mit einer ncAA anstelle des Tryptophans. Interessanterweise wird durch die frühe Expression von L-HDAg mehr HDV sekretiert und die Infektiosität dieser Partikel erhöht. Wir konnten L-HDAg sowohl in transfizierten Zellen als auch in aufgereinigten Viren mit einem Click-Chemie Fluorophor markieren. In dieser Arbeit wird die Persistenz der HBV cccDNA in infizierten Zellen hervorgehoben. Zum Erhalt der cccDNA wird der Reimport von Nukleokapsiden nicht benötigt. Diese Erkenntnis deutet darauf hin, dass Behandlungen, die die Produktion von Nukleokapsiden inhibieren, wahrscheinlich nicht genügen, um cccDNA zu eliminieren. Zudem bildet die Fluoreszenzmarkierung von HBV und HDV mittels Amber Suppression eine neue Grundlage, um virale Eintrittsprozesse zu visualisieren.