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Abstract

Despite recent advances in drug development for cancer immunotherapy, only two monoclonal antibodies have been approved for the treatment of multiple myeloma, among them is elotuzumab, an anti-SLAMF7 antibody. Its mechanism of action has previously been only partly described in terms of NK cell activation and direct antibody dependent cellular cytotoxicity; however, the effect of elotuzumab on T cells has not yet been studied. Therefore, I sought to examine whether SLAMF7 is expressed on T cells, its function in T cells, and the effect of elotuzumab binding to T cells in patients with MM. I analysed SLAMF7 expression on T cells from patients with MM before and after induction therapy with or without elotuzumab. I also utilized the CRISPR-Cas9 knockout model of SLAMF7 to examine its function and RNA transcriptomic sequencing approach. Moreover, I performed extensive immunological functional analyses to study the effect of the abundance of SLAMF7+ T cells and the immune response on tumour cells. In the first study, I found that SLAMF7 was expressed on T cells, especially on CD8+ T cells. CD4+ T cells showed modest expression. Thus, I further investigated the immunophenotype of SLAMF7+ CD8+ T cells and found that these cells showed a similar phenotype to CD8+ CD28- CD57+ T cells, a subpopulation previously described by a colleague to exert immunosuppressive capacity to promote tumour growth. Moreover, I found that they expressed high levels of exhaustion markers, indicating that they had an exhausted phenotype as well. Using CRISPR Cas9 knockout model in T cells, I found that there was no significant difference between SLAMF7 knockout and control T cells, suggesting that SLAMF7 is a marker for dysfunction and not an initiator of exhaustion in T cells. ELISPOT functional assay with T cell from patients showed that patients with a high frequency of CD8+ T cells exhibit weaker anti-tumour cytotoxic activity. Adding SLAMF7+ CD8+ T cells from myeloma patients suppressed the antigen-specific T cell response of healthy donors T cells in my analyses. Clinically, I found a strong decrease in SLAMF7+ CD8+ T cells after induction therapy in patients who received elotuzumab. Therefore, I hypothesized that elotuzumab might induce antibody dependent cellular phagocytosis a of SLAMF7+ CD8+ T cells. In cooperation with Heiko Bruns at Erlangen University, I found that the majority of SLAMF7+ CD8+ T cells were phagocytosed by autologous phagocytes after adding elotuzumab in vitro. To confirm the finding in vivo, Hakim Echchannaoui at Mainz University and used a similar approach in a myeloma mouse model, and we observed consistent finding. After confirming the cells` depletion mechanism, I also checked for a possible role for natural killer cells in the elimination of T cells but found no evidence. Given these findings, I then investigated how Natural killer cells escape phagocytosis despite expressing SLAMF7 by analysing CD47, which is a phagocytosis-inhibiting (‘don’t eat me’) marker, on natural killer cells and comparing it to the expression on T cells. Comparatively, natural killer cells expressed much higher level of CD47 than T cells, highlighting a potential survival advantage against elotuzumab-induced phagocytosis. In summary, I have shed new light on a key mechanism of action of an anti-SLAMF7 antibody against immunosuppressive CD8+ T cells. Previously, anti-SLAMF7 antibodies were thought to act by targeting myeloma cells directly or by bringing together NK cells and myeloma cells. The findings detailed in my work provide evidence for another therapeutic mechanism. This mechanism, together with the clinical findings, provide a novel potential immune target for the future immunotherapy approaches.

Translation of abstract (German)

Trotz der Fortschritte in der immuntherapeutischen Entwicklung sind bisher nur zwei monoklonale Antikörper für die Behandlung des Multiplen Myeloms zugelassen. Einer davon ist Elotuzumab, ein spezifischer Antikörper der gegen SLAMF7. Der Wirkmechanismus von Elotuzumab ist bisher nur teilweise beschrieben, zum einen zeigt sich eine direkte zelluläre Zytotoxizität des Antikörpers gegen Zellen des Multiplen Myeloms, zum anderen eine Modulation von „natürlichen Killer Zellen“. Die Wirkung von Elotuzumab auf T-Zellen, die ebenfalls auf ihrer Oberfläche SLAMF7 exprimieren, wurde bisher nicht analysiert. Ziel meiner Arbeit war zu untersuchen, auf welchen T-Zell Populationen SLAMF7 exprimiert wird, seine Funktion in T-Zellen zu beschreiben und den Einfluss von Elotuzumab auf T-Zellen bei Patienten mit Multiplem Myelom zu demonstrieren. Ich analysierte die SLAMF7-Expression auf T-Zellen von Patienten mit Multiplem Myelom vor und nach einer Induktionschemotherapie mit oder ohne Elotuzumab. Desweitern verwendeten wir ein SLAMF7 CRISPR-Cas9-Knock-out-Modell, um dessen Funktion zusammen mit einem Hochdurchsatz-RNA-Transkriptom-Sequenzierungsansatz zu analysieren. Darüber hinaus habe ich umfangreiche immunologische Funktionsanalysen durchgeführt, um den Einfluss von SLAMF7-positiven T-Zellen bezüglich der Immunantwort auf Zellen des Multiplen Myeloms zu untersuchen. Als erstes Ergebnis stellte ich fest, dass SLAMF7 auf T-Zellen, insbesondere auf CD8+ T-Zellen, exprimiert wurde, CD4+ T-Zellen zeigten dagegen nur eine geringe Expression. In weitergehenden Untersuchungen des Immunphänotyp von SLAMF7+ CD8+ T-Zellen fand ich heraus, dass diese Zellen einen ähnlichen Phänotyp wie CD8+ CD28- CD57+ T-Zellen aufweisen, eine Subpopulation, die bereits als immunsuppressiv in der Literatur beschrieben wurde. Den suppressiven Charakter dieser Zellpopulation konnte ich molekularbiologisch mittels RNA-Sequenzierung weiter bestätigen. ELISPOT-Assays mit T-Zellen von Patienten mit einer hohen und niedrigen Frequenz von SLAMF7+ CD8+ T-Zellen zeigten, dass Patienten mit einer hohen Frequenz von SLAMF7+ CD8+ T-Zellen eine schwächere zytotoxische Aktivität haben. In einem weiteren Experiment, bei dem ich T-Zellen von gesunden Spendern in An- oder Abwesenheit von SLAMF7+ CD8+ T-Zellen, die aus Myelom-Patienten isoliert wurden, kultivierte, stellte ich fest, dass die Zugabe von SLAMF7+ CD8+ T-Zellen die antigenspezifische T-Zellantwort unterdrückte. Dieses Ergebnis bestätigte den immunsuppressiven Charakter dieser T-Zellen. Mittels Analysen der SLAMF7-Expression aus dem peripheren Blut der Patienten vor und nach einer Induktionstherapie mit oder ohne Elotuzumab innerhalb der GMMG HD7 Studie konnte ich zeigen, dass eine starke Abnahme der Anzahl der SLAMF7+ CD8+ T-Zellen nach der Induktionstherapie bei Patienten die Elotuzumab erhielten, auftritt. In Zusammenarbeit mit Heiko Bruns von der Universität Erlangen fanden wir heraus, dass die Mehrheit der SLAMF7+ CD8+ T-Zellen nach Zugabe von Elotuzumab in vitro von autologen Makrophagen phagozytiert wurde. Um diesen Befund in vivo zu bestätigen, haben Hakim Echchannaoui von der Universität Mainz und ich einen ähnlichen Ansatz in einem Myelom-Mausmodell durchgeführt. Nach der Injektion von SLAMF7+ CD8+ T-Zellen, die gegen den in diesen Mäusen etablierten Tumorklon des Multiplen Myeloms gerichtet waren, zeigten die Mäuse, die Elotuzumab erhielten, weniger tumorinfiltrierende SLAMF7+ CD8+ T-Zellen. Das bestätigte, dass auch in diesem Versuchsaufbau diese Zellen durch Elotuzumab wurden. Meine Arbeit wirft ein neues Licht auf den immunologischen Wirkmechanismus des Anti-SLAMF7-Antikörpers Elotuzumab. Bisher ging man davon aus, dass der Anti-SLAMF7-Antikörper nur dann wirkt, wenn er direkt auf Myelomzellen abzielt oder wenn er „natürliche Killer-Zellen“ moduliert. Die in meiner Arbeit dargelegten Befunde sprechen für einen weiteren therapeutischen Mechanismus, der die Elimination von immunsuppressive T-Zellen betrifft. Dieser Mechanismus könnte für immuntherapeutische Ansätze, nicht nur beim Multiplen Myelom, sondern auch bei anderen Tumorentitäten von Bedeutung sein.