German Title: Anti-Tumorigene Effekte des Eisenchelators Ciclopirox in HPV-Positiven Krebszellen

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Abstract

Oncogenic human papillomaviruses (HPVs) account for 5% of the total cancer incidence, being causal agents of cervical, other anogenital and oropharyngeal cancers. Innovative treatment options for HPV-induced cancers are thus urgently required. Metabolic alterations constitute one of the hallmarks of cancer, suggesting metabolic modulators such as iron chelators as a promising strategy for cancer therapy. In line with this, the iron chelating antifungal drug ciclopirox (CPX) showed promising anti-tumorigenic effects in numerous preclinical tumor models, including cervical cancer cells. In HPV-positive tumor cells, CPX suppresses expression of the viral E6/E7 oncogenes and induces senescence or apoptosis. This thesis aimed to delineate the mechanisms underlying these anti-tumorigenic effects in cervical cancer cells and more specifically to gain insights into the determinants governing the switch from senescence to apoptosis. By analyzing data from a comprehensive proteome screen of CPX-treated HPV16-positive tumor cells potential pathways involved in its anti-tumorigenic capacity were identified, including the induction of tumor-suppressive Notch signaling and deregulation of the cellular energy metabolism. The latter effect could be corroborated by demonstrating that CPX represses factors involved in oxidative phosphorylation (OXPHOS), accompanied by an upregulation of glycolysis related proteins. Consequently, the anti-tumorigenic effects of CPX were strongly glucose-dependent in that limited glucose availability facilitated the induction of apoptosis, while increased glucose supply prevented CPX-mediated cell death – a regulation shared by established OXPHOS inhibitors such as the anti-diabetic drug metformin. Instead, under glucose-replete conditions CPX-treated cells underwent senescence, which was not observed for metformin and other OXPHOS inhibitors, but for other iron chelators. Moreover, it was shown that viral E6/E7 repression by CPX, metformin and other OXPHOS inhibitors is prevented by increasing glucose supply, indicating a vulnerability of HPV-oncogene expression to energy depletion. Additionally, experiments in E6/E7 expressing normal keratinocytes point towards a sensitizing role of the viral oncogenes towards CPX-treatment. Finally, it was demonstrated that CPX synergistically enhances the growth-suppressing effects of radiotherapy, cisplatin and glycolysis inhibitors in HPV-positive cancer cells. Collectively, the present study reveals a profound glucose-dependence of the anti-tumorigenic effects exerted by CPX and links its capacity to induce senescence or apoptosis to its dual role as an iron chelator and OXPHOS inhibitor, respectively. These results provide novel insights into the regulation of critical tumor-suppressive pathways in cervical cancer cells, illuminate the anti-proliferative activities of CPX and may facilitate the development of rational combination therapies comprised of CPX and glycolytic inhibitors to induce metabolic synthetic lethality in HPV-positive tumor cells.

Translation of abstract (German)

Onkogene humane Papillomviren (HPVs) sind verantwortlich für 5% der Krebsinzidenz und verursachen neben Gebärmutterhalskrebs weitere Karzinome im Anogenitalbereich sowie im Oropharynx. Innovative Behandlungsmöglichkeiten für HPV-positive Tumore werden dringend benötigt. Da Veränderungen des Zellstoffwechsels eines der zentralen Merkmale von Krebszellen darstellen, könnten metabolische Modulatoren rationale Behandlungsmöglichkeiten bieten. So weisen zahlreiche präklinische Untersuchungen auf das therapeutische Potential des Eisenchelators Ciclopirox (CPX) in verschiedenen Tumormodellen hin, unter anderem auch in Zervixkarzinomzellen. In HPV-positiven Tumorzellen unterdrückt CPX die Expression der viralen E6- und E7-Onkogene und induziert Seneszenz oder Apoptose. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die dieser Regulation zugrundeliegenden Mechanismen aufzuklären und Erkenntnisse zu den Faktoren zu erlangen, welche die Entscheidung von Zervixkarzinomzellen zwischen Seneszenz und Apoptose bestimmen. Die Analyse von Proteomdaten CPX-behandelter HPV16-positiver Tumorzellen ermöglichte es, zelluläre Prozesse zu identifizieren, welche eine Rolle für die Wachstumshemmung durch CPX spielen könnten. Unter anderem wurde gezeigt, dass CPX den Tumorsuppressor Notch aktiviert und den zellulären Energiestoffwechel dereguliert. Letzteres äußerte sich unter anderem in der Hemmung von Faktoren, welche in der oxidativen Phosphorylierung (OXPHOS) involviert sind, bei gleichzeitiger Induktion von glykolytischen Faktoren. Entsprechend zeigte sich, dass der Effekt von CPX stark glukoseabhängig ist – niedrige Glukosekonzentrationen begünstigten die Induktion von Apoptose, während hohe Glukosekonzentrationen den Zelltod verhinderten. Stattdessen resultierte eine Behandlung mit CPX unter höherem Glukoseangebot in der Induktion von Seneszenz. Andere OXPHOS-Inhibitoren, z.B. das Antidiabetikum Metformin, führten ebenfalls zu einem glukoseabhängigen Zelltod, konnten jedoch keine Seneszenz auslösen. Hingegen induzierten andere Eisenchelatoren – wie CPX – Seneszenz und bei Glukosemangel Apoptose. Auch die Repression der viralen E6/E7-Onkogene durch CPX, Metformin oder andere OXPHOS-Inhibitoren wurde durch eine gesteigerte Glukosekonzentration verhindert, was auf eine Abhängigkeit der HPV-Onkogene vom zellulären Energiestatus hindeutet. Zusätzlich weisen Experimente in E6/E7-exprimierenden immortalisierten Keratinozyten darauf hin, dass die HPV Onkogene Zellen für eine CPX-Behandlung sensibilisieren. Schließlich wurde in Kombinationsbehandlungen gezeigt, dass CPX die wachstumshemmenden Effekte von Radiotherapie, Cisplatin und Glykolyse-Inhibitoren synergistisch verstärkt. Zusammenfassend deckt die präsentierte Arbeit eine starke Glukoseabhängigkeit der anti-tumorigenen Effekte von CPX auf und führt die Induktion von Apoptose oder Seneszenz auf die Bifunktionalität von CPX als OXPHOS-Inhibitor und Eisenchelator zurück. Diese Ergebnisse geben Einblicke in die Regulation wichtiger tumorsuppressiver Signalwege in Zervixkarzinomzellen, beleuchten die wachstumshemmenden Effekte von CPX und könnten als Basis für die Entwicklung rationaler Kombinationstherapien von CPX mit Glykolyse-Inhibitoren dienen, welche in HPV-positiven Tumorzellen synthetisch letal wirken.