German Title: Untersuchungen zu Inhibitoren von Nukleosid-Diphosphat-Kinasen wie z mutmaßliche neuartige Therapeutika zur Behandlung von Herzinsuffizienz

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Abstract

Impaired cAMP signaling and dysfunctional calcium handling in cardiomyocytes are both characteristics associated with heart failure. So far, therapeutic attempts to improve contractile function by globally increasing cAMP levels failed clinically due to higher arrhythmia susceptibility and increased risk of sudden cardiac death. Novel strategies aiming to modulate distinct cAMP pools in cardiomyocytes may improve contraction force without detrimental effects. Nucleoside diphosphate kinase (NDPK), an enzyme with transphosphorylase activity, contributes to heterotrimeric G protein activation by GTP formation from ATP and GDP. Moreover, oligomers consisting of the isoforms NDPK B and C form a complex with heterotrimeric G proteins and act as protein histidine kinase on the G subunit leading to direct activation of the G protein. NDPK C is upregulated in end-stage human heart failure, where it promotes the complex formation of NDPKs with Gi proteins and enhances their activity. This likely contributes to the suppression of cAMP formation. Therefore, this project aims to identify compounds that inhibit NDPK B and C and investigate the consequences of NDPK inhibition in heart muscle. To screen for potential inhibitors of NDPK activity, recombinantly expressed human NDPK A, B, and C were purified. An ATP-dependent, firefly luciferase-based luminescence assay was used to quantify the amount of ATP formed from GTP+ADP, monitoring the NDPK transphosphorylase activity. Out of the tested library, one small molecule compound (SanWie3) preferentially reduced the activity of NDPK C > NDPK B >> NDPK A. Further in vitro studies revealed that SanWie3 is an allosteric inhibitor of the transphosphorylase activity of NDPK C (IC50 ~ 3 μM). Biophysical protein analyses confirmed that binding of SanWie3 mediates small structural changes in the NDPK C protein. Preliminary studies on the binding of SanWie3, using HDX-mass spectrometry and in silico protein modeling, identified a putative binding pocket near the catalytically active site. The potential off-target binding of SanWie3 on other enzymes, channels, and receptors was studied using in vitro screens, which did not suggest any additional SanWie3 targets so far. Previously, we reported that the knockdown of NDPK C reduced the isoproterenol-induced cAMP in neonatal rat cardiomyocytes (NRCM). Therefore, cAMP formation and PKA-dependent protein phosphorylation were analyzed in NRCM and adult mouse ventricular cardiomyocytes (AMVCM), stimulated with isoproterenol (ISO). SanWie3 attenuated the ISO-induced cAMP formation in NRCM, consistent with the reported complex formation of NDPK C with Gs proteins. In accordance, the SanWie3-induced deprivation of cAMP reduced the phosphorylation of the cAMP/PKA downstream target phospholamban (PLN). Surprisingly SanWie3 treatment of AMVCM and measuring cAMP pools by differentially targeted cAMP-Förster resonance energy transfer (FRET) suggested a different function in AMVCM. Here, SanWie3 caused an increase of ISO-induced cAMP levels in the PLN/SERCA2a subdomain and the PKA-dependent PLN phosphorylation. The ISOinduced cAMP formation and PKA-dependent phosphorylation of other targets in other cellular domains (cytosol, plasma membrane, and ryanodine receptor-2-subdomain) were unchanged. Consistently, the influence of SanWie3 on calcium handling in AMVCM showed an accelerated basal Ca2+ reuptake, an increase in the basal sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ load, and an increase in Ca2+ transients and spontaneous Ca2+ spark frequency. To analyze the effect of SanWie3 on ISO-induced ventricular contraction, cardiac muscle stripes from rats were isolated, and force development was measured in an organ bath. This significant increase in ISO-induced contractility was associated with an increase in PLN phosphorylation. As in AMVCM, the effect of SanWie3 on ISO-induced PLN phosphorylation was mimicked by the inhibition of Gi activity by pertussis toxin treatment; the results suggest a constitutive activation of Gi by NDPK C in a signalosome controlling PLN/SERCA2a activity, thereby modulating Ca2+ load and cardiomyocyte contractility. The results demonstrate that the identified small molecular inhibitor SanWie3, which preferentially attenuates the enzymatic activity of NDPK C, modulates cAMP-dependent signaling in NRCM and AMVCM preferentially in the PLN/SERCA2a subdomain. Therefore, SanWie3 may be a lead compound in designing small molecules able to relieve the detrimental suppression of cAMP signaling in specific cellular compartments in cardiomyocytes occurring in heart failure.

Translation of abstract (German)

Beeinträchtigte cAMP-abhängige Signaltransduktion und dysfunktionales Calcium-Handling in Kardiomyozyten sind zwei mit der Herzinsuffizienz verbundene, charakteristische Merkmale. Bisherige therapeutische Versuche zur Verbesserung der kontraktilen Funktion durch globale Erhöhung der cAMP-Spiegel scheiterten klinisch aufgrund einer höheren Anfälligkeit für Herzrhythmusstörungen und eines erhöhten Risikos für plötzlichen Herztod. Neue Strategien, die darauf abzielen, distinkte cAMP-Pools in Kardiomyozyten zu modulieren, könnten jedoch eine Verbesserung der Kontraktionskraft ohne nachteilige Auswirkungen ermöglichen. Nukleosiddiphosphatkinase (NDPK), ein Enzym mit Transphosphorylase-Aktivität, trägt zur heterotrimeren G Protein Aktivierung durch GTP-Bildung aus ATP und GDP bei. Darüber hinaus bilden Oligomere aus den Isoformen NDPK B und C einen Komplex mit heterotrimeren G Proteinen und wirken als Protein-Histidin-Kinase an der Gβ-Untereinheit, was zu einer direkten Aktivierung des G Proteins führt. NDPK C wird bei höhergradiger, menschlicher Herzinsuffizienz hochreguliert, wobei das Protein die Komplexbildung von NDPKs mit Gi Proteinen und damit eine Steigerung der Gi Aktivität fördert. Dies trägt wahrscheinlich zu einer verstärkten Unterdrückung der cAMP-Bildung bei. Daher zielt dieses Projekt darauf ab, Verbindungen zu identifizieren, die NDPK B und C hemmen und die Folgen einer Hemmung der NDPK-Aktivität im Herzmuskel zu untersuchen. Um potenzielle Inhibitoren der NDPK Aktivität zu identifizieren, wurden die humanen Isoformen NDPK A, B und C rekombinant exprimiert und aufgereinigt. Ein ATP-abhängiger Lumineszenz-Assay auf Luziferase-Basis wurde verwendet, um die Menge von aus GTP + ADP gebildetem ATP zu quantifizieren und damit die NDPK-Transphosphorylase-Aktivität zu bestimmen. Aus der getesteten Substanz-Bibliothek wurde eine niedermolekulare Verbindung (SanWie3) identifiziert, die bevorzugt die Aktivität von NDPK C > NDPK B >> NDPK A reduzierte. Weitere in vitro Studien zeigten, dass SanWie3 ein allosterischer Inhibitor der Transphosphorylase-Aktivität der NDPK C (IC50 ~ 3 µM) ist. Biophysikalische Proteinanalysen bestätigten, dass die Bindung von SanWie3 kleine strukturelle Veränderungen im NDPK C- Protein hervorrufen. Vorstudien zur Bindung von SanWie3 mit HDX-Massenspektrometrie und in silico Proteinmodellierung identifizierten eine mutmaßliche Bindungstasche in der Nähe des katalytisch aktiven Zentrums. Potenzielle Off-Target-Effekte von SanWie3 auf andere Enzyme, Kanäle und Rezeptoren wurde in weiteren in vitro Screenings untersucht, die bisher keine Hinweise auf weitere SanWie3-Targets ergaben. Publizierte Ergebnisse zeigten, dass der Knockdown von NDPK C Isoproterenol (ISO)-induzierte Bildung von cAMP in Kardiomyozyten aus neonatalen Ratten (NRCM) reduzierte. Daher wurden die cAMP-Bildung sowie die PKA- abhängige Proteinphosphorylierung in NRCM und adulten ventrikulären Kardiomyozyten der Maus (AMVCM) unter ISO-Stimulation untersucht. SanWie3 schwächte die ISO-induzierte cAMP-Bildung und cAMP/PKA-abhängige Phosphorylierung von Phospholamban (PLN) inNRCM ab, was mit der berichteten Komplexbildung von NDPK C mit Gs-Proteinen in NRCM übereinstimmte. Überraschenderweise wurde in SanWie3 behandelten: AMVCM durch Messung von cAMP- Pools mittels differenziell gerichteten cAMP-Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) eine andere Regulation beobachtet, die auf eine andere Kopplung der NDPK C deutet. Hier verursachte SanWie3 einen Anstieg der ISO-induzierten cAMP-Spiegel in der SERCA/PLN- Subdomäne und entsprechend eine Verstärkung der PKA-abhängigen PLN-Phosphorylierung. Die ISO-induzierte cAMP-Bildung und PKA-abhängige Phosphorylierung anderer Ziele in anderen zellulären Domänen (Cytosol, Plasmamembran und Ryanodin-Rezeptor-2- Subdomäne) waren unverändert. Konsequenterweise zeigte der Einfluss von SanWie3 auf das Calcium-Handling bei AMVCM eine beschleunigte basale Ca2+ -Wiederaufnahme, eine Erhöhung der basalen sarkoplasmatischen Retikulum (SR) Ca2+ -Beladung, eine Erhöhung der Ca2+ -Transienten und der spontanen Ca2+-Freisetzung. Um die Wirkung von SanWie3 auf ISO- induzierte ventrikuläre Kontraktion zu analysieren, wurden Herzmuskelstreifen von Ratten isoliert und die Kraftentwicklung im Organbad gemessen. Hier zeigte sich ein signifikanter Anstieg der ISO-induzierten Kontraktilität, der mit einem Anstieg der PLN-Phosphorylierung assoziiert war. Interessanter Weise, wurde die Wirkung von SanWie3 auf die ISO-induzierte PLN- Phosphorylierung durch die Hemmung der Gi Aktivität mittels Pertussis-toxin imitiert. Diese Ergebnisse deuten daher auf eine konstitutive Aktivierung von Gi durch NDPK C in einem Signalosom hin, dass die PLN/SERCA2a-Aktivität und damit indirekt die Kontraktilität der Kardiomyozyten kontrolliert. Zusammenfassend zeigen die Daten, dass der niedermolekulare NDPK C Inhibitor SanWie3, die cAMP-abhängige Signalgebung bei NRCM und AMVCM vorzugsweise in der PLN/SERCA2a-Subdomäne moduliert. SanWie3 kann daher eine chemische Leitstruktur zum Design von Molekülen sein, die in der Lage sind, die konstitutive, kontraproduktiveUnterdrückung der cAMP-Signaltransduktion in bestimmten zellulären Kompartimenten von Kardiomyozyten in der Herzinsuffizienz abzuschwächen.