German Title: Molekulare und klinische Bedeutung von FOXR2 in pädiatrischen Krebserkrankungen

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Abstract

Cancer is the leading disease-related cause of death in children in the European Union and the United States. Therefore, better diagnostics and novel therapeutic approaches are urgently needed to improve the outcome of pediatric cancer patients. Advances in modern sequencing technologies provided the basis for a substantial increase of knowledge, leading to the molecular understanding of pediatric malignancies that we have today. The identification and characterization of cancer-driving oncogenes is key to enable a differentiated molecular and clinical view on tumor entities and to find specific therapeutic approaches that are based on the mode of action. In this study, I investigated the molecular and clinical role of the oncogene FOXR2 in pediatric cancer. The first chapter sheds light on the clinical and mechanistic role of FOXR2 in peripheral neuroblastoma. Since neuroblastoma shows a broad spectrum of clinical outcomes, ranging from spontaneous tumor regression to disease related death, the understanding of mechanisms that induce and drive the tumor is crucial for risk stratification and targeted treatment of patients. I therefore investigated gene expression and clinical data of 1.030 neuroblastoma patients of three independent cohorts and studied the implications of silencing FOXR2 expression in vitro. Furthermore, the mechanistic role of FOXR2 was analyzed in cell lines and patient samples. In the total neuroblastoma cohort, FOXR2 expression was present in 9% of neuroblastoma patients and turned out to be a prognostic factor indicating unfavorable survival of patients with 10-year overall survival rates of 53% to 59%. Importantly, FOXR2 expression indicated poor survival independently from well-established prognostic markers including MYCN amplification, INSS4, age at diagnosis above 18 months or high-risk stage. In vitro, the knockdown of FOXR2 resulted in reduced cell proliferation, cell death, cell cycle arrest and reduced MYCN protein levels, indicating the essential role of FOXR2 for tumor progression. Furthermore, FOXR2 expressing neuroblastoma showed a high transcriptional similarity to MYCN-amplified cases, suggesting a common mechanism driving the tumors. In line with this, it was observed that FOXR2 protein binds and stabilizes MYC and MYCN protein and in patient samples MYCN levels in FOXR2 mRNA expressing tumors are highly increased. Overall, these results indicate that the stabilization mechanism of FOXR2 and MYCN represent an alternative to MYCN amplifications in neuroblastoma leading to a similar transcriptional signature indicative of an aggressive tumor. In line with this, FOXR2 identifies a novel and independent prognostic factor in neuroblastoma indicating unfavorable clinical outcome and improving risk stratification of this clinically highly heterogeneous tumor type. In the second chapter, molecular and clinical characteristics of CNS neuroblastoma with FOXR2 activation (CNS NB-FOXR2) were described and analyzed based on collaborations with Katja von Hoff et al. and Andrey Korshunov et al. CNS NB-FOXR2 tumors were only recently described by Sturm and colleagues and emerged from institutionally diagnosed CNS primitive neuroectodermal tumors (PNET). CNS-PNET are highly aggressive and poorly differentiated embryonal tumors with a poor outcome. However, first analyses in small cohorts of molecularly re-evaluated CNS-PNET suggest that the poor outcome for this group of tumors is mostly driven by misclassified high-grade gliomas (HGG). To further investigate the clinical characteristics of CNS NB-FOXR2, tissue samples and clinical data of 307 histologically diagnosed CNS-PNET were collected and molecularly re-evaluated. Out of 307 cases, 36 cases were classified as CNS NB-FOXR2 by means of DNA methylation profiling. These patients clearly showed a favorable survival with a 5-year overall survival rate of 85%. In contrast to CNS NB-FOXR2, the 5-year overall survival of the entire CNS-PNET cohort is 51%, which can be attributed to the poor overall survival of ETMR and HGG (24% and 25%, respectively) that were also molecularly identified in the CNS-PNET cohort. These results provide a differentiated clinical view and point out the need for an adjusted treatment strategy for CNS NB-FOXR2, now listed as a new distinct entity of embryonal tumors in the 2021 update of the “WHO classification of tumors of the central nervous system”. In the context of an additional collaborative effort, we aimed to identify immunohistochemical markers for CNS NB-FOXR2 to clearly discriminate them from morphological mimics. Therefore, 84 CNS-PNET cases were molecularly re-evaluated using DNA methylation profiling, resulting in the identification of 20 CNS NB-FOXR2 in this cohort. Based on differential gene expression analyses the expression of SOX10 and ANKRD55 was identified to discriminate CNS NB-FOXR2 from histologically diagnosed CNS-PNET. By means of immunohistochemistry, these results were validated on protein level, staining 20 CNS NB-FOXR2 and a variety of other pediatric CNS tumors that can present CNS-PNET like morphologies, including amongst others ependymoma , ETMR, AT/RT and several high-grade gliomas. Indeed, the combined expression of SOX10 and ANKRD55 protein was found to clearly identify CNS NB-FOXR2 from morphological mimics. Taken together, this study has shown that FOXR2 represents an independent prognostic factor in peripheral neuroblastoma, identifying patients with unfavorable survival. Additionally, the mechanistic interaction of FOXR2 and MYCN leading to a stabilization of the high-risk associated oncogene MYCN was described for the first time. Moreover, in the context of this study clinical characteristics of the novel brain tumor entity CNS NB-FOXR2 were revealed and diagnostic markers to distinguish CNS NB-FOXR2 from morphological mimics were identified.

Translation of abstract (German)

Krebs gilt als häufigste Todesursache bei Krankheiten im Kinder- und Jugendalter in der Europäischen Union und in den Vereinigten Staaten. Daher sind dringend eine präzise Diagnostik und neue therapeutische Ansätze erforderlich, um den klinischen Verlauf pädiatrischer Krebspatienten zu verbessern. Heutzutage bieten moderne Sequenzierungstechnologien die Möglichkeit molekulare Mechanismen und Eigenschaften von Tumoren zu erforschen, was zu einem rasanten Wissenszuwachs im Feld der pädiatrischen Onkologie geführt hat. Schlüsselfaktoren sind hierbei die Identifizierung und Charakterisierung von krebsverursachenden Onkogenen, die es ermöglichen, eine differenzierte molekulare und klinische Perspektive auf verschiedene Tumoreinheiten sowie auf dem Wirkmechanismus basierende therapeutische Ansätze zu entwickeln. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde die molekulare und klinische Bedeutung des Onkogens FOXR2 in pädiatrischen Krebserkrankungen untersucht. Im ersten Kapitel wird die klinische und mechanistische Funktion von FOXR2 in peripheren Neuroblastomen beleuchtet. Diese weisen ein breites Spektrum an klinischen Verläufen auf, die von spontaner Regression bis hin zu aggressiver Ausbreitung des Tumors mit Todesfolge reichen. Ein präzises Verständnis der Mechanismen, die zur Tumorentstehung und Ausbreitung führen, ist daher zur Risikostratifizierung und zielgerichteten Behandlung von Neuroblastompatienten erforderlich. In dieser Studie wurden Genexpressions- und klinische Daten von 1030 Neuroblastompatienten untersucht. Des Weiteren wurden die Auswirkungen eines shRNA induzierten Knockdowns von FOXR2 in vitro sowie die mechanistische Rolle von FOXR2 in Zelllinien und Patientenproben erforscht. Insgesamt wurde in 9% der Neuroblastompatienten eine erhöhte FOXR2 Expression detektiert. Diese Patienten zeigten in den drei untersuchten Datensätzen einen schlechten klinischen Verlauf mit einer 10-Jahres Gesamtüberlebensrate von 53% bis 59%. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die Expression von FOXR2 Patienten mit schlechten Überlebensraten identifiziert, unabhängig von bereits etablierten prognostischen Markern wie MYCN Amplifikation, INSS4, einem Diagnosealter von über 18 Monaten oder Hochrisiko-Stadium. In vitro führte der Knockdown von FOXR2 zu einer verringerten Zellproliferation, Zelltod, Verlangsamung des Zellzyklus und zu einer geringeren MYCN Proteinexpression, was die essentielle Rolle von FOXR2 für die Ausbreitung des Tumors unterstreicht. Des Weiteren wurde festgestellt, dass FOXR2 exprimierende und MYCN amplifizierte Neuroblastome eine ähnliche transkriptionelle Signatur aufweisen, was auf einen gemeinsamen tumortreibenden Mechanismus hinweist. Tatsächlich wurde in vitro gezeigt, dass FOXR2 Protein an MYC und MYCN Protein bindet und es dadurch stabilisiert. Auch in Patientenproben wurden stark erhöhte MYCN Proteinmengen in FOXR2 exprimierenden Neuroblastomen nachgewiesen. Diese Ergebnisse zeigen, dass der stabilisierende Einfluss von FOXR2 auf MYCN eine Alternative zu MYCN Amplifikationen in Neuroblastomen darstellt. Die Expression von FOXR2 definiert somit einen neuen und unabhängigen prognostischen Faktor, der schlechte Gesamtüberlebensraten bei Patienten mit Neuroblastom anzeigt und verbessert die Risikostratifizierung dieser klinisch heterogenen Krebsart. Im zweiten Kapitel wurden molekulare und klinische Charakteristika von Neuroblastomen des zentralen Nervensystems mit FOXR2 Aktivierung (CNS NB-FOXR2) in Kollaborationen mit Katja von Hoff et al. und Andrey Korshunov et al. beschrieben und analysiert. CNS NB-FOXR2 wurden erstmals im Rahmen einer molekularen Charakterisierung von institutionell diagnostizierten primitiven neuroektodermalen Tumoren des zentralen Nervensystems (CNS-PNET) von Sturm et al. beschrieben. Bei diesen handelt es sich um hoch aggressive und wenig differenzierte embryonale Tumore mit zunächst vermutetem schlechten klinischen Verlauf. Erste Analysen in kleineren Kohorten von re-evaluierten CNS-PNETs haben jedoch gezeigt, dass der schlechte klinische Verlauf in vielen Fällen auf fälschlich als CNS-PNET klassifizierte hochgradige Gliome (HGG) zurückzuführen ist. Um die klinischen Charakteristika von CNS NB-FOXR2 tiefer zu erforschen, wurden Gewebeproben und klinische Daten von 307 histologisch diagnostizierten CNS-PNET gesammelt und auf molekularer Ebene re-evaluiert. In 36 von 307 Fallen wurden CNS NB-FOXR2 mittels DNA Methylierungsanalyse klassifiziert. Diese Patienten wiesen eine günstige 5-Jahres Gesamtüberlebensrate von 85% auf. Im Gegensatz zu CNS NB-FOXR2 zeigten die Gesamtkohorte der CNS-PNET eine 5-Jahres Gesamtüberlebensrate von nur 51 % auf, welche hauptsächlich auf die schlechte Gesamtüberlebensrate von (molekular bestätigten) ETMR und HGG (24%, bzw. 25%) zurückgeführt werden kann. Diese Ergebnisse ermöglichen somit eine differenzierte klinische Betrachtung und unterstreichen die Notwendigkeit für eine angepasste Behandlungsstrategie für CNS NB-FOXR2, die in der im Jahr 2021 veröffentlichten 5. Auflage der „WHO classification of tumors of the central nervous system“ gelistet sind. Im Rahmen einer weiteren Studie wurden diagnostische Marker für CNS NB-FOXR2 analysiert, um diese von morphologisch ähnlichen Entitäten zu unterscheiden. Zu diesem Zweck wurden 84 CNS-PNET auf molekularer Ebene mittels DNA Methylierungsanalyse re-evaluiert. Insgesamt konnten 20 CNS NB-FOXR2 in dieser Kohorte ausgemacht werden. Basierend auf Genexpressionsanalysen wurden SOX10 und ANKRD55 als spezifisch in CNS NB-FOXR2 exprimierte Gene identifiziert. Mittels immunohistochemischer Färbungen wurde die Expression dieser Gene auf Proteinebene validiert. Dafür wurden 20 CNS NB-FOXR2 sowie eine Vielzahl anderer pädiatrischer CNS Tumore, welche die Morphologie von CNS-PNET aufweisen können (einschließlich Ependymoma, ETMR, AT/RT und mehrere HGG), immunohistochemisch evaluiert. Diese Vorgehensweise ergab, dass die kombinierte Expression der Proteine SOX10 und ANKRD55 CNS NB-FOXR2 sehr präzise von morphologisch ähnlichen Entitäten unterscheiden kann. Zusammenfassend wurde im Rahmen dieser Doktorarbeit FOXR2 als unabhängiger prognostischer Faktor in peripheren Neuroblastomen entdeckt, welcher mit einem ungünstigen klinischen Verlauf assoziiert ist. Darüber hinaus wurde erstmals die mechanistische Interaktion von FOXR2 und MYCN beschrieben, welche die Stabilisierung des Hochrisiko-assoziierten Onkogens MYCN zur Folge hat. Des Weiteren wurden klinische Charakteristika der kürzlich erstmalig beschriebenen Tumorentität CNS NB-FOXR2 erfasst und diagnostische Marker identifiziert, die CNS NB-FOXR2 von morphologisch ähnlichen Entitäten unterscheiden können.