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Biological Assessment and Tests of Activity of Two Novel Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs)

Gama Brambila, Rodrigo Antonio

[thumbnail of Rodrigo Gama Brambila doctoral thesis.pdf]
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In the last 20 years the Proteolysis Targeting Chimera (PROTAC) technology has revolutionized the field of drug discovery. PORTACs are heterobifunctional molecules consisting of a chemical ligand, named in this context warhead, and an E3 ligase recruiter united by a linker. These molecules bring the Ubiquitin Proteasome System machinery into the proximity of a protein of interest through for temporal and reversible degradation without the need of genetic manipulation. In comparison to classical chemical inhibitors, PROTACs provide a new approach to repress the activity of a pathogenic protein, which is independent of its catalytic or enzymatic activity. Because of lack of chemical binders, just a small fraction of the proteome has been reported to be targeted by PROTACs.

To increase the number of proteins prone to be targeted by PROTACs, two strategies are followed in this work, exemplified by two new PROTACs. First, the incorporation of a perfluoroaromatic moiety within the structure of the degrader, which can target the sulfhydryl motif in the cysteine residue of the sequence Phe-Cys-Pro-Phe in a nucleophilic aromatic substitution reaction. This tetrapeptide was inserted into the C-terminus of Cas9 (Cas9FCPF), while the perfluoroaromatic moiety was tether to Lenalidomide, a broadly used ligand and recruiter of the E3 ligase cereblon. The resulting PROTAC-FCPF successfully degraded Cas9FCPF in a time- and concentration-dependent manner, with a Ubiquitin Proteasome System (UPS)-driven proved mechanism with a half-degradation concentration (DC50) of around 150 nM over 24 hours treatment. PROTAC-FCPF was also effective against genetically engineered related proteins dCas9FCPF, Cas12FCPF, and Cas13FCPF, all modified to have the Phe-Cys-Pro-Phe sequence inserted in their C-termini. The second strategy was High-Throughput Screening, out of which the compound O4I2 was identified to chemically induce the expression of the Yamanaka factor Oct4 and, thus, supported the induction of somatic cell reprogramming and maintenance of human induced Pluripotent Stem cells. In a proteomics analysis of cells treated with O4I2, it was observed that the Splicing Factor 3 Subunit 1 (SF3B1) was the main hit, a protein that has been associated to several tumors. To target it, O4I2 was bound to another cereblon recruiter, Thalidomide. The resulting PROTAC-O4I2 successfully degraded SF3B1 in a time- and concentration-dependent manner, driven by the UPS with a DC50 of 244 nM over 24 hours of treatment. Furthermore, the degrader spared other proteins that were also hits during the proteomics analysis, and successfully degraded the mutant SF3B1K700E, present in 55% of patients with myelodysplastic syndromes.

Translation of abstract (German)

In den letzten 20 Jahren hat die Proteolysis Targeting Chimera (PROTAC)-Technologie die Wirkstoffforschung revolutioniert. PORTACs sind heterobifunktionelle Moleküle, die aus einem chemischen Liganden, in diesem Zusammenhang Gefechtskopf genannt, und einem durch einen Linker verbundenen E3-Ligase-Recruiter bestehen. Diese Moleküle bringen die Maschinerie des Ubiquitin-Proteasom-Systems in die Nähe eines interessierenden Proteins für einen zeitlichen und reversiblen Abbau ohne die Notwendigkeit einer genetischen Manipulation. Im Vergleich zu klassischen chemischen Inhibitoren bieten PROTACs einen neuen Ansatz zur Unterdrückung der Aktivität eines pathogenen Proteins, der unabhängig von seiner katalytischen oder enzymatischen Aktivität ist. Aufgrund des Mangels an chemischen Bindemitteln wurde berichtet, dass nur ein kleiner Bruchteil des Proteoms von PROTACs angegriffen wird.

Um die Größe von Proteinen zu erhöhen, die anfällig für das Targeting von PROTACs sind, werden in dieser Arbeit zwei Strategien verfolgt, um zwei neue PROTACs zu produzieren. Erstens der Einbau einer perfluoraromatischen Einheit innerhalb der Struktur des Abbauvermittlers, die in einer nukleophilen aromatischen Substitutionsreaktion auf das Sulfhydryl-Motiv des Cysteinrests der Sequenz Phe-Cys-Pro-Phe abzielen kann. Dieses Tetrapeptid wurde in den C-Terminus von Cas9 (Cas9FCPF) eingefügt, während die perfluoraromatische Einheit an Lenalidomid gebunden war, einem weit verbreiteten Liganden und Rekrutierer der E3-Ligase Cereblon. Das resultierende PROTAC-FCPF baute Cas9FCPF erfolgreich zeit- und konzentrationsabhängig ab, mit einem vom Ubiquitin Proteasom System (UPS) gesteuerten Mechanismus mit einer halben Abbaukonzentration (DC50) von etwa 150 nM über 24 Stunden Behandlung. PROTAC-FCPF war auch gegen gentechnisch veränderte verwandte Proteine dCas9FCPF, Cas12FCPF und Cas13FCPF wirksam, die alle so modifiziert waren, dass sie an ihren C-Termini die Phe-Cys-Pro-Phe- Sequenz inseriert hatten. Für die zweite Strategie wurde eine neue Verbindung O4I2 genutzt, die in einem High- Throughput-Screening auf Faktoren, die die Expression des Yamanaka-Faktors Oct4 chemisch induzieren können gefunden wird. O4I2 verbessert die Expression von Oct4 und kann die Reprogrammierung somatischer Zellen und die Erhaltung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen unterstützen. In einer Proteomikanalyse von mit O4I2 behandelten Zellen wurde beobachtet, dass die Splicing Factor 3 Subunit 1 (SF3B1) der Haupttreffer war, ein Protein, das mit mehreren Tumoren in Verbindung gebracht wurde. Um die Targetspezifität zu zeigen wurde O4I2 an Thalidomid als Rekrutierer für die Ubiquitinligase cereblon gebunden. Das resultierende PROTAC-O4I2 baute SF3B1 zeit- und konzentrationsabhängig erfolgreich ab, vermittelt über UPS mit einer DC50 von 244 nM über 24 Stunden Behandlung. Darüber hinaus verschonte der neue O4I2-Talidomid Abbauvermittler andere Proteine, die als weitere Treffer in der Proteomik-Analyse gefunden wurden, baute jedoch sehr erfolgreich die Mutante SF3B1K700E ab, die bei 55% der Patienten mit myelodysplastischen Syndromen vorhanden ist.

Document type: Dissertation
Supervisor: Wölfl, Prof. Dr. Stefan
Place of Publication: Heidelberg
Date of thesis defense: 4 May 2022
Date Deposited: 23 May 2022 11:26
Date: 2022
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Institute of Pharmacy and Molecular Biotechnology
DDC-classification: 500 Natural sciences and mathematics
570 Life sciences
Controlled Keywords: PROTAC, Targeted protein degradation, Proteasomal degradation
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