German Title: Proximitäts-Markierung an Membrankontaktstellen enthüllt GRAMD1B als einen Steroltransporter, der an der Lysosom-ER Kontaktfläche agiert

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Abstract

Contact sites between membranes of different cellular organelles are involved in a wide variety of biological processes. While many of the key factors involved in their formation have been identified and many proteins that act primarily at these contact sites have been studied extensively, a comprehensive picture of both the architecture but also the function of these contacts is still missing. This lack of knowledge is to a large degree due to the small dimensions of these interfacing membranes, which make their identification and analysis using conventional methods rather challenging. This work establishes a proximity-labelling assay based on a split biotin ligase connected to known protein tether-pairs at three distinct contact sites of the endoplasmic reticulum (ER) with lysosomes, mitochondria and endosomes, respectively. Proteins that were biotinylated at these membrane contact sites were then identified by mass spectrometry based proteomics. The resulting list of identified hits contained both novel proteins, as well as proteins that had previously been reported to fulfill a role at membrane contact sites, highlighting the efficacy of the assay. The function of one such protein, GRAMD1B, was investigated further. This protein is essential for non-vesicular cholesterol import to the ER from the plasma membrane, but was also found to locate to contact sites with lysosomes and interact with the major lysosomal cholesterol exporting protein, NPC1. Results of the split biotin ligase assay confirmed a localization at lysosome-ER contact site, which led us to further study its function at this contact. Using a lysosomally prelocalized, modified cholesterol probe in GRAMD1B-overexpressing cells, pulse-chase measurements of cholesterol esterification suggested an involvement of GRAMD1B in two separate lysosome-to-ER transport processes with different temporal scales: A fast and direct cholesterol transport at lysosome-ER contacts dependent on NPC1 as well as an import from the plasma membrane to the ER at slower timescales. This was substantiated by the fact that the impact of GRAMD1B-overexpression on the faster transport process was reduced by NPC1-deficiency, while trapping of cholesterol at the plasma membrane only reduced the effect at later time points. In addition, live-cell microscopic analysis showed GRAMD1B’s ability to recruit ER tubules to cholesterol-laden lysosomes and confirmed a dependency on the presence of NPC1 in the lysosomal membrane. This further strengthens the hypothesis of a dual role of GRAMD1B in the transport of cholesterol to the ER, with spatial coupling of two cholesterol transporters at the lysosome-ER interface. Overall, this work shows that proximity labelling using split biotin ligase fragments fused to known contact site tether pairs is a powerful tool to identify proteins acting at organelle contacts. One such protein, GRAMD1B, acts in multiple routes of subcellular cholesterol trafficking, where this work focusses on its function in direct lysosome-to-ER transport of sterols. The applied methods, particularly the use of modified cholesterol probes prelocalized to lysosomes to observe lysosomal egress, as well as the insights gained from studying GRAMD1B’s actions at lysosome-ER contacts, will contribute to a more comprehensive understanding of subcellular cholesterol homeostasis, which, in turn, is relevant for a wide variety of physiological and pathophysiological processes.

Translation of abstract (German)

Kontaktstellen zwischen Membranen verschiedener Zell-Organellen spielen eine wichtige Rolle in zahlreichen biologischen Abläufen. Viele der Schlüsselfaktoren, die an ihrer Bildung beteiligt sind, wurden bereits identifiziert, und viele Proteine, die vorrangig an diesen Kontaktstellen agieren, sind ausgiebig untersucht worden – doch was bisher aussteht, ist ein vollständiges Bild sowohl der Architektur als auch der Funktion dieser Kontakte. Dass dieses Wissen noch fehlt, liegt zu einem großen Teil an den geringen Ausmaßen dieser miteinander in Verbindung stehenden Membranen, was ihre Identifikation und Analyse mit herkömmlichen Methoden zu einer großen Herausforderung macht. Die vorliegende Arbeit etabliert eine Methode zur Proximitäts-Markierung an Membrankontaktstellen, basierend auf einer gespaltenen Biotin-Ligase (Split-BioID), die an drei bekannten Paaren von Tether-Proteinen angebracht wurde, welche sich an Kontaktstellen des endoplasmatischen Retikulums (ER) mit Lysosomen, Mitochondrien oder Endosomen befinden. Proteine, die an diesen Membrankontaktstellen biotinyliert wurden, wurden anschließend durch massenspektrometrische Proteomik identifiziert. Die daraus resultierende Liste der identifizierten Treffer enthielt sowohl neuartige Proteine als auch Proteine, von denen bereits zuvor berichtet worden war, dass sie eine Rolle an Membrankontaktstellen spielen, was die Wirksamkeit dieser Methode unterstreicht. Die Funktion eines dieser Proteine, GRAMD1B, wurde genauer untersucht. Dieses Protein spielt eine essentielle Rolle für den nicht-vesikulären Cholesterinimport aus der Plasmamembran in das endoplasmatische Retikulum, es wurde jedoch auch festgestellt, dass es sich an Kontaktstellen mit Lysosomen befindet und mit dem wichtigsten lysosomalen Cholesterinexport-Protein, NPC1, interagiert. Die Ergebnisse des Split-BioID Ansatzes bestätigten ein vermehrtes Vorkommen des Proteins an der Kontaktstelle zwischen Lysosomen und dem ER, was mich dazu veranlasste, seine Funktion an dieser Position genauer zu untersuchen. Unter Verwendung eines lysosomal vorlokalisierenden, modifizierten Cholesterinanalogs in GRAMD1B-überexprimierenden Zellen, deuteten Puls-Chase-Messungen der Cholesterinveresterung auf eine Beteiligung von GRAMD1B an zwei separaten Transportprozessen von Lysosomen zum ER mit unterschiedlichen Zeitskalen hin: Ein schneller und direkter Cholesterintransport an Lysosom-ER-Kontaktstellen, der von NPC1 abhängig ist, sowie ein Import von der Plasmamembran zum ER über eine längere Zeitspanne. Dies wurde durch die Tatsache untermauert, dass der Einfluss der GRAMD1B-Überexprimierung auf den schnellen Transportprozess durch einen Mangel an NPC1 verringert wurde, während die Immobilisierung von Cholesterin an der Plasmamembran den Effekt nur zu späteren Zeitpunkten reduzierte. Eine mikroskopische Analyse in lebenden Zellen zeigte darüber hinaus, dass GRAMD1B die Fähigkeit besitzt, ER-Tubuli zu cholesterinbeladenen Lysosomen zu rekrutieren, und bestätigte zudem eine Abhängigkeit von der Präsenz von NPC1 in der lysosomalen Membran. Dies untermauert die Hypothese einer doppelten Rolle von GRAMD1B beim Transport von Cholesterin zum ER, mit einer räumlichen Kopplung von zwei Cholesterintransport-Proteinen an der Kontaktfläche zwischen Lysosom und ER. Insgesamt zeigt die vorliegende Arbeit, dass die Proximitäts-Markierung unter Verwendung von Fragmenten einer gespaltenen Biotin-Ligase, die mit bekannten Kontaktstellen-Tether-Paaren verknüpft sind, ein leistungsfähiges Werkzeug darstellt, um Proteine zu identifizieren, die an Kontaktstellen von Organellen agieren. Eines dieser Proteine, GRAMD1B, spielt bei mehreren Routen des subzellulären Cholesterintransports eine Rolle, wobei sich die vorliegende Arbeit auf seine Funktion beim direkten Transport von Sterolen von Lysosomen zum ER konzentriert. Die angewandten Methoden, insbesondere die Verwendung eines modifizierten Cholesterinanalogs, das in Lysosomen vorlokalisiert, für die Beobachtung des Austritts aus Lysosomen, sowie die Erkenntnisse, die aus der Untersuchung der Aktivitäten von GRAMD1B an Lysosom-ER-Kontaktstellen gewonnen wurden, werden zu einem umfassenderen Verständnis der subzellulären Cholesterin-Homöostase beitragen, welche wiederum für eine große Bandbreite von physiologischen und pathophysiologischen Prozessen relevant ist.