German Title: Substraterkennung und -spaltung durch die mitochondriale Rhomboid-Protease PARL

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Abstract

Proteases have evolved in all kingdoms of life with the capability to catalyze irreversible and highly regulated hydrolysis of peptide bonds. Intramembrane proteases share common features as such enzymes are polytopic membrane proteins with their active sites buried several Ångstrom deep within the lipid bilayer. Although the list of physiological substrates is steadily growing, an important remaining question is whether these proteases have a conserved substrate recognition mechanism. In the present thesis, I focused on the human mitochondrial rhomboid protease PARL and its substrate recognition and cleavage mechanism on the example of PGAM5. Dysfunctional mitochondrial quality control disturbs cellular energy metabolism and programmed cell death, triggering disruptive diseases such like neurodegeneration. Genetic deficiency of PGAM5 causes a Parkinson’s-like movement disorder in mice. PARL serves as a safeguard of mitochondrial homeostasis and is processing PGAM5 when the mitochondrial membrane potential is disrupted. Until today, PGAM5 substrate determinants have not been rigorously investigated. Here, I characterize for the first time several cleavage determinants in PGAM5 on basis of mutational studies in human tissue culture, in vitro proteolytic assays with purified recombinant proteins and in a collaborative project using CD spectroscopy and liquid-state NMR. I can show that the N-terminal portion of the PGAM5 TM domain plays a special role and is a critical determinant for PARL-catalyzed processing. Interestingly, besides cleavage resistant forms, I obtained PGAM5 mutants with highly increased cleavage by PARL uncoupling it from its native regulation. NMR analysis revealed that the PGAM5 TM domain harbors two split helices zoned by a hinge-like loop and mutations within the N- or C-terminal helix suggest an altered interaction with PARL or bending into the PARL active site with subsequent modified intramembrane cleavage. Moreover, I found that a balanced net charge in the C-terminal juxtamembrane region prevents premature PGAM5 from PARL-catalyzed cleavage so that cleavage-resistant PGAM5 oligomers can assemble upon mitochondrial import. Under mitochondrial stress after disruption of the membrane potential with CCCP, I propose a model in which PGAM5 oligomers at the inner mitochondrial membrane disassemble into monomers by an unknown mechanism leading to efficient cleavage by PARL in order to trigger PGAM5’s downstream activities. Taken together, my findings indicate that the substrate recognition mechanism of PARL relies on a membrane-potential-dependent oligomeric switch and different substrate features with hierarchical importance.

Translation of abstract (German)

Proteasen haben in allen Lebenswesen die Fähigkeit entwickelt, Peptidbindungen durch irreversible und stark regulierte Hydrolyse zu spalten. Intramembranproteasen haben einige gemeinsame Merkmale, wie ihre polytopische Struktur, in welcher die katalytischen Zentren mehrere Ångstrom tief in der Lipiddoppelschicht verborgen sind. Obwohl die Liste der physiologischen Substrate stetig wächst, bleibt die Frage, ob diese Proteasen einen konservierten Substraterkennungsmechanismus aufweisen. In der vorliegenden Arbeit habe ich mich auf die Substraterkennung und -spaltung der menschlichen mitochondrialen Rhomboidprotease PARL am Beispiel des Substrats PGAM5 konzentriert. Eine dysfunktionale mitochondriale Qualitätskontrolle stört nicht nur den Energiestoffwechsel der Zellen, sondern auch die Aktivierung des programmierten Zelltods und kann folglich Krankheiten wie Neurodegeneration auslösen. Ein genetischer Mangel an PGAM5 führt bei Mäusen zu einer Parkinson-ähnlichen Bewegungsstörung. Die Rhomboidprotease PARL schützt das mitochondriale Gleichgewicht und prozessiert PGAM5, wenn das innere Membranpotential gestört ist. Bis heute wurden die genauen PGAM5- Substraterkennungsmuster nicht untersucht. Hier charakterisiere ich zum ersten Mal mehrere Spaltungsdeterminanten in PGAM5 auf Basis von Mutationsstudien in humaner Zellkultur, in vitro Proteolyse-Assays mit aufgereinigten rekombinanten Proteinen und in einem kollaborativen Projekt durch CD-Spektroskopie und Flüssigzustands-NMR. Ich kann zeigen, dass der N-terminale Teil der PGAM5 TM-Domäne eine besondere Rolle spielt und eine kritische Determinante für die PARL-katalysierte Prozessierung ist. Interessanterweise erhielt ich neben spaltungsresistenten Formen PGAM5-Mutanten mit stark erhöhter Spaltung, in welcher sie von ihrer nativen Regulation entkoppelt waren. NMR-Analyse zeigte, dass die PGAM5 TM-Domäne zwei geteilte Helices beherbergt, die durch eine gelenkartige Schleife zoniert sind. Mutationen innerhalb der N- oder C-terminalen Helix deuten auf eine veränderte Interaktion mit PARL oder Biegung in das aktive Zentrum von PARL mit anschließender modifizierter Intramembranspaltung hin. Außerdem fand ich heraus, dass eine ausgewogene Nettoladung in der C-terminalen Juxtamembran-Region eine vorzeitige Spaltung von PGAM5 durch PARL verhindert, so dass sich spaltungsresistente PGAM5-Oligomere beim mitochondrialen Import bilden können. Unter mitochondrialem Stress durch Entkopplung des Membranpotentials mit CCCP schlage ich ein Modell vor, in dem PGAM5-Oligomere in der inneren mitochondrialen Membran durch einen unbekannten Mechanismus in Monomere zerfallen, was in einer effizienten Spaltung durch PARL resultiert, um die nachgeschalteten Aktivitäten von PGAM5 auszulösen. Zusammenfassend zeigen meine Ergebnisse, dass der Substraterkennungsmechanismus von PARL auf einem membranpotentialabhängigen, oligomeren Schalter und verschiedenen Substratmerkmalen mit hierarchischer Bedeutung beruht.