German Title: Ein gepoolter CRISPR/Cas9-Screen zur Identifizierung von Genen, die im Zusammenwirken mit epigenetische Medikamente synthetisch letal sind, in Zellen des nicht-kleinzelligen Bronchialkarzinoms

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Abstract

Lung cancer is the most common cause of cancer-related death worldwide, resulting in 1.3 million deaths per year. Most lung tumors are non-small cell lung cancers (NSCLC), and approximately 11 % of NSCLC harbor a mutation in the oncogenic KRAS gene. The clinical success of epigenetic drugs has been minimal in NSCLC, with no exception for the KRAS mutant NSCLC subtype. This project aimed to identify genes that act synthetically lethal with epigenetic drugs to better understand the resistance mechanisms to these compounds in NSCLC cells, focusing on KRAS mutant cells. Target genes were identified using a pooled CRISPR/Cas9 screening approach, which was established in this project. Four genes synthetically lethal with the histone methyltransferase inhibitor DZNep were identified in KRAS mutant H2030 cells, and two genes were identified as synthetically lethal with the histone deacetylase inhibitor Entinostat in the same cell line. The epigenetic regulators CHD8 and EP300 were selected among the target genes for further characterization. In silico analysis of CHD8 and EP300 in the TCGA NSCLC dataset revealed a strong positive correlation of the expression of both genes and indicated functional overlaps. The synthetically lethal effect of CHD8 or EP300 depletion with DZNep treatment was validated in the KRAS-mutant cell line H1944 but lacking in EGFR-mutant H1975 cells. Flow cytometry analysis confirmed elevated apoptosis in H2030, but not H1975 cells, after DZNep treatment in conjunction with CHD8 or EP300 knockdown. Gene expression profiling and functional annotation of deregulated genes after DZNep treatment in combination with CHD8 or EP300 knockdown verified a high number of affected cell-cycle and cell viability-related genes. The cytokine CCL20 was identified as upregulated by DZNep but downregulated upon knockdown of CHD8 or EP300, suggesting a role in conferring CHD8 or EP300-mediated resistance to DZNep treatment in H2030 cells. Proof of concept experiments showed that CHD8 is critical for the upregulation of CCL20 upon DZNep treatment in mutant H2030 cells and that a knockdown of CCL20 mimics the synthetically lethal effect of CHD8 depletion with DZNep treatment.

Translation of abstract (German)

Mit 1,3 Millionen Todesfällen pro Jahr ist Lungenkrebs weltweit die häufigste krebsbedingte Todesursache. Die Mehrzahl der Lungentumoren sind nicht-kleinzellige Bronchialkarzinome (non-small cell lung cancer, NSCLC). Etwa 11 % aller NSCLC weisen eine Mutation im onkogenen KRAS-Gen auf. Der klinische Erfolg von epigenetischen Inhibitoren war in NSCLC bisher minimal, ohne Ausnahme für den KRAS-mutierten NSCLC-Subtyp. Dieses Projekt hatte zum Ziel, in KRAS-mutierten NSCLC Zellen solche Gene zu identifizieren, deren Entfernung aus der Zelle zusammen mit der Gabe von epigenetischen Inhibitoren synthetisch letal wirkt. Die Erkenntnisse dieser Studie sollen helfen, die Resistenzmechanismen gegen epigenetische Inhibitoren besser zu verstehen. Die Zielgene wurden mit Hilfe eines CRISPR/Cas9-Screens identifiziert, der im Rahmen dieses Projekts etabliert wurde. Vier Gene, die mit dem Histonmethyltransferase-Inhibitor DZNep synthetisch letal sind, wurden in KRAS-mutierten H2030-Zellen identifiziert. Zwei weitere Gene wurden mit dem Histondeacetylase-Inhibitor Entinostat in derselben Zelllinie als synthetisch letal identifiziert. Die epigenetischen Regulatoren CHD8 und EP300 wurden aus den Zielgenen für die weitere Charakterisierung ausgewählt. Die Analyse von CHD8 und EP300 im TCGA-NSCLC-Datensatz zeigte eine positive Korrelation der Expression beider Gene und deutete auf funktionelle Überschneidungen hin. Ein knockdown von CHD8 oder EP300 unter DZNep-Behandlung in der KRAS-mutanten Zelllinie H1944 zeigte -identisch zu H2030 Zellen- eine synthetische Letalität und erhöhte Apoptose, in EGFR-mutierten H1975-Zellen zeigte sich diese jedoch nicht. Microarray-Genexpressionsanalysen verifizierten eine hohe Anzahl deregulierter Zellzyklus- und Zellviabilitätsgene. Das Zytokin CCL20 wurde als möglicher Mediator einer CHD8- oder EP300-vermittelten Resistenz gegen DZNep in H2030-Zellen identifiziert. Initiale Experimente zeigten, dass CHD8 eine zentrale Rolle für die erhöhte Expression von CCL20 nach einer DZNep-Behandlung in KRAS-mutierten H2030-Zellen einnimmt und dass ein knockdown von CCL20 ebenfalls eine synthetische Letalität mit einer DZNep Behandlung der Zellen aufweist.