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Abstract

During the past decades, highly pathogenic arthropod-borne viruses (arboviruses) have emerged globally, posing a threat to public health. Arboviruses not only replicate in their vertebrate hosts but feature a dual life cycle with a switch to and from their arthropod vector. This switch is difficult to reproduce experimentally, and the link between infectivity and the molecular features acquired by arboviruses in arthropod vectors or mammalian hosts remains elusive. Moreover, only a few host factors have been functionally described for arbovirus infections. In this thesis, the tick-borne Uukuniemi virus (UUKV) was used as a surrogate system to explore the molecular features of Phenuiviridae, a large family of highly pathogenic arboviruses in the order Bunyavirales. Label-free proteomic mass spectrometry analysis revealed that GBF1 interacts with the UUKV glycoproteins. Golgicide A-mediated inhibition of GBF1-driven intracellular vesicle trafficking and siRNA-mediated silencing of GBF1 impaired UUKV infection, demonstrating that GBF1 is involved in UUKV replication and egress. GBF1 appeared to be important for a broad range of RNA viruses budding from the endoplasmic reticulum and Golgi networks. Then, lipidomic mass spectrometry analysis indicated that hexosylceramide (HexCer) is enriched in infected cells and in the envelope of UUKV particles. Pharmacological inhibition of the synthesis of the HexCer glucosylceramide (GlcCer) in producer cells resulted in viral progeny with reduced infectivity, likely due to defects in virion binding to target cells. I also found that other bunyaviruses rely on GlcCer for infectious entry. Finally, I established protocols for UUKV production and purification from both tick vector cells and mammalian host cells. Cryo-electron microscopy showed that viral particles were smaller and more heterogenous in size when UUKV was derived from tick cells. In sum, my thesis allowed the identification of general infection-promoting factors, not only for UUKV, but also for other viruses that bud from the endoplasmic reticulum and Golgi compartments. Strikingly, GlcCer is the first example of a glycolipid mediating virion attachment. My work lays the basis for future studies in virus-receptor interactions and comparative analysis of viral particles produced from their mammalian host and arthropod vector cells. Elucidating these molecular features and related functional processes is paramount to prepare for the emergence of future phenuiviruses and other arboviruses.

Translation of abstract (German)

Während der letzten Jahrzehnte gewannen hochpathogene, durch Arthropoden übertragene Viren (Arboviren), weltweit an Bedeutung und stellen eine Herausforderung für die Gesundheitswesen vieler Länder dar. Arboviren vermehren sich nicht nur in ihrem Wirt, sondern verfügen über einen doppelten Lebenszyklus, der ihnen einen Wechsel zu und von ihrem jeweiligen Arthropodenvektor ermöglicht. Dieser natürliche Vorgang ist experimentell schwer zu reproduzieren. Darum sind die molekularen Merkmale, welche die Virionen in Arthropoden- oder Säugetierzellen erwerben, und deren mögliche Verbindung zur Infektiosität nach wie vor unklar. Außerdem wurden bisher nur wenige Wirtsfaktoren identifiziert, die an der Infektion mit Arboviren beteiligt sind, und für viele von diesen müssen die Funktionen noch im Detail aufgeklärt werden. Mit Hilfe hochauflösender markierungsfreier Proteomik und Lipidomik Massenspektrometrie identifizierte ich neue Wirtsfaktoren und Eigenschaften des Uukuniemi Virus (UUKV). Bei diesem Virus handelt es sich um ein Surrogat System für hochpathogene Phenuiviren. Ergebnisse der Proteom Analyse der aus Säugetierzellen gewonnenen Virionen wiesen darauf hin, dass der Golgi-spezifische Brefeldin-A-resistente Guanin-Nukleotid-Austauschfaktor 1 (GBF1) mit den UUKV Glykoproteinen interagierte. Sowohl die durch Golgicide A vermittelte Hemmung des GBF1-gesteuerten intrazellulären Vesikeltransports als auch das durch siRNA vermittelte Silencing von GBF1 reduzierten die UUKV Infektionslevel. Eine eingehende Analyse des viralen Infektionszyklus ergab, dass GBF1 an der UUKV Replikation und dem Virenaustritt beteiligt ist. Außerdem konnte ich durch Lipidom-Analysen nachweisen, dass Hexosylceramid (HexCer) sowohl in infizierten Zellen als auch in der Hülle von UUKV-Partikeln angereichert ist. Die pharmakologische Hemmung der Synthese des HexCer Glucosylceramid (GlcCer) in produzierenden Zellen führte zu einer verminderten Infektiosität von UUKV-Partikeln. Dies könnte durch eine beeinträchtigte Binding des Virus an die Zielzellen verursacht werden. Darüber hinaus etablierte und optimierte ich Protokolle für die Produktion und Aufreinigung von UUKV aus Zeckenzellen. Kryo-Elektronenmikroskopie zeigte, dass die aus Zeckenzellen produzierten Partikel einen kleineren Durchmesser hatten als die aus Säugetierzellen gewonnenen Virionen. Diese Arbeit bildet die Grundlage für zukünftige vergleichende Studien von Viruspartikeln, die aus Zeckenzellen und solchen, die aus Säugetierzellen stammen. XIII Ich habe in dieser Arbeit neue Wirtsfaktoren identifiziert, die bei der UUKV-Infektion eine zentrale Rolle spielen. So ist das vom Wirt stammende Lipid GlcCer an der Bindung an die Zielzellen beteiligt und ist damit das erste Beispiel für ein Glykolipid, das die Anheftung des Virions vermittelt. Generell könnten sowohl GBF1 als auch GlcCer bei Viren beteiligt sein, die aus dem Endoplasmatischen Retikulum und dem Golgi-Apparat knospen. Die mechanistische Grundlage dieser Prozesse wird in künftigen Studien von entscheidender Bedeutung sein. Vor allem therapeutische Ansätze könnten sich diese Wirkungsweise zu Nutze machen, um auf mögliche künftige Ausbrüche von Arboviren besser vorbereitet zu sein.