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Abstract

Protein O-mannosylation is a conserved modification of proteins with the sugar mannose. Defective O-mannosylation of the peripheral membrane protein α-dystroglycan (α-DG) results in a spectrum of congenital diseases called dystroglycanopathies (DGpathies). DGpathies manifest a broad range of symptoms from serious, prenatal changes in the morphology of the brain to adult-onset muscular dystrophy. Consequently, mutations in the genes encoding the protein O-mannosyltransferases 1 and 2 (POMT1/2), which catalyse the first steps of O-mannosylation, cause the most severe forms of DGpathies. Why different organs are distinctly affected in patients with varying grades of DGpathies is not clear. Moreover, the precise contribution of the known substrates of the POMT1-POMT2 complex, α-DG, SUCO and KIAA1549, to the pathology in DGpathies remains ill-defined. Therefore, the aim of this thesis was to resolve the organismal role of the POMT1-POMT2 complex in DGpathies and to disentangle the contributions of its substrates.

To address these questions, I created a framework for highly efficient base editing to mutate virtually any cytosine or adenine in the teleost fish genome. Using CRISPR/Cas9 and base editors, I established pomt2 DGpathy models in medaka (Oryzias latipes) and characterised these using behavioural, biochemical, histological and transcriptomic analyses. I could show that organs such as the eye and the brain are only affected when POMT-complex function was substantially disrupted. By contrast, the muscles and spine are much more prone to minute changes in the enzymatic properties of the POMTs. Next, I disrupted the POMT-substrates individually using a CRISPR/Cas9 approach. I identified a previously unknown cardiovascular function of α-DG and SUCO, and revealed that SUCO plays an important role in notochord development. Finally, I employed base editing to mutate O-mannosylation glycosites on α-DG (T330) and SUCO (S806 and T811), which partially recapitulated respective loss-of-function phenotypes. With this first-ever evidence for the study of glycosites using base editing in vivo, I demonstrate the feasibility of this new approach to provide functional insights in a developing organism.

Future studies linking structure-function relationships on the substrate level to tissue-wide developmental consequences in model systems will be instrumental to enable tailored, preclinical drug screens and to provide reliable predictions of disease progressions in DGpathies.

Translation of abstract (German)

Die O-Mannosylierung von Proteinen ist eine konservierte Modifikation von Proteinen mit dem Zucker Mannose. Eine fehlerhafte O-Mannosylierung des peripheren Membranproteins α-Dystroglykan (α-DG) führt zu einem Spektrum von angeborenen Krankheiten, die als Dystroglykanopathien (DGpathien) bezeichnet werden. DGpathien weisen eine Vielzahl unterschiedlicher Symptome auf, die von schwerwiegenden pränatalen Veränderungen der Gehirnmorphologie bis hin zur Muskeldystrophie im Erwachsenenalter reichen. Die schwersten Formen von DGpathien werden folglich von Mutationen in Genen, die für die Protein O-Mannosyltransferasen 1 und 2 (POMT1/2) kodieren, verursacht, da diese die ersten Schritte der O-Mannosylierung katalysieren. Warum verschiedene Organe bei Patienten mit unterschiedlichen Schweregraden von DGpathien unterschiedlich stark betroffen sind, ist noch nicht eindeutig erforscht. Darüber hinaus ist der genaue Beitrag der bekannten Substrate des POMT1-POMT2-Komplexes, α-DG, SUCO und KIAA1549, zum Krankheitsbild von DGpathien nach wie vor nicht klar definiert. Ziel dieser Arbeit war es daher, die organismische Rolle des POMT1-POMT2-Komplexes bei DGpathien zu klären und die Funktionen seiner Substrate zu entschlüsseln.

Um diese Fragen zu beantworten, habe ich eine Methode für hocheffizientes Base Editing etabliert, mit dem im Grunde jedes Cytosin oder Adenin im Genom von Teleostfischen mutiert werden kann. Mithilfe von CRISPR/Cas9 und Base Editoren habe ich pomt2 DGpathie-Modelle in Medaka (Oryzias latipes) etabliert und diese anhand von biochemischen, histologischen, transkriptomischen und Verhaltensanalysen charakterisiert. Ich konnte zeigen, dass Organe wie das Auge und das Gehirn nur dann betroffen sind, wenn die Funktion des POMT-Komplexes erheblich gestört ist. Im Gegensatz dazu sind Muskeln und Wirbelsäule viel anfälliger für geringe Veränderungen der enzymatischen Eigenschaften der POMTs. Anschließend habe ich einzelne Substrate des POMT-Komplexes mithilfe von CRISPR/Cas9 verändert. Dadurch konnte ich eine bislang unbekannte kardiovaskuläre Funktion von α-DG und SUCO identifizieren und zeigen, dass SUCO eine wichtige Rolle in der Entwicklung des Notochords spielt. Schließlich habe ich durch Base Editing O-Mannosylierungsstellen in α-DG (T330) und SUCO (S806 und T811) mutiert, was wiederum zu einem partiellen Funktionsverlust führte. Mit dieser erstmaligen Untersuchung von Glykosylierungsstellen durch Base Editing in vivo konnte ich den Nutzen dieses Ansatzes zur Gewinnung funktioneller Erkenntnisse in einem sich entwickelnden Organismus demonstrieren.

Zukünftige Studien, die Struktur-Funktions-Beziehungen auf Substratebene mit gewebeübergreifenden Entwicklungskonsequenzen in Modellsystemen verknüpfen, werden entscheidend sein, um maßgeschneiderte präklinische Wirkstoffscreens zu ermöglichen und so zuverlässige Vorhersagen über den Krankheitsverlauf bei DGpathien zu liefern.