German Title: Die Rolle von Membranbindungskomplexen im vakuolären Transport und der Vakuolenbiogenese

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Abstract

The lytic vacuole is vital for the plant cell, as the vacuole fulfills essential functions, such as degradation, detoxification, storage and generation of the turgor pressure. Secondary active transport and degradation processes require the energy provided by the tonoplast-localized V-ATPase and V-PPase. By studying the vacuolar trafficking of the V-ATPase and the V-PPase a trafficking route independent of the Golgi and mediated by provacuoles was discovered. To further investigate the Golgi-independent trafficking and its role in vacuole biogenesis, conditional expression of Sar1b-GTP to disrupt COPII-mediated trafficking was studied. The tonoplast-localized V-ATPase can be transported independent of the COPII route to the vacuole. With a genetic piggyback system and conditional expression of VHA-a3 punctate and tubular structures likely being provacuoles were examined in vivo. The role of the conserved membrane tethering complexes HOPS and CORVET in vacuolar trafficking was investigated. In Arabidopsis, the HOPS complex mediates vacuolar trafficking from the Golgi via AP-3 vesicles and from the TGN/EE via MVBs, similar to its function in yeast and mammalian cells. CORVET evolved a new role and operates a plant-specific transport route from the TGN/EE to the vacuole. A population of the tonoplast-localized V-ATPase and V-PPase enters a Golgi-dependent pathway, which passes through the TGN/EE and RAB5-positive LEs, which require the CORVET membrane tethering complex for fusion with the vacuole. However, neither the HOPS nor the CORVET complex seems to play a role in membrane fusion between provacuoles and the vacuole. Tonoplast-localized proton pumps can be sorted into provacuoles as well as into COPII vesicles. Thereby, tonoplast-localized proton pumps can exit the ER via two distinct routes and the distribution between the two trafficking routes might be adaptable to environmental or developmental cues. In meristematic root cells, the vacuole is composed of a single, tubular network, whose integrity is maintained by the HOPS complex. Homotypic vacuole fusion occurs via the formation of vertex rings. Unlike in yeast cells, the V-ATPase is not required for homotypic vacuole fusion. However, the balance of the signaling lipid PI3P at the vacuolar membrane is crucial for proper fusion events at the vacuole.

Translation of abstract (German)

Die lytische Vakuole ist für die Pflanzenzelle lebenswichtig, da die Vakuole wesentliche Funktionen wie Abbau, Entgiftung, Speicherung und Erzeugung des Turgordrucks erfüllt. Sekundäre aktive Transport- und Abbauprozesse benötigen die Energie, die von den am Tonoplasten lokalisierten V-ATPase und V-PPase bereitgestellt wird. Durch die Untersuchung des vakuolären Transports der V-ATPase und der V-PPase wurde ein vom Golgi unabhängiger und durch Provakuolen vermittelter Transportweg entdeckt. Zur weiteren Untersuchung des Golgi-unabhängigen Transports und seiner Rolle in der Biogenese von Vakuolen wurde die konditionelle Expression von Sar1b-GTP zur Unterbrechung des COPII-vermittelten Transports analysiert. Die am Tonoplasten lokalisierte V-ATPase kann unabhängig vom COPII-Weg zur Vakuole transportiert werden. Mit einem genetischen Huckepack-System und der konditionellen Expression von VHA-a3 wurden punkt- und schlauchförmige Strukturen, bei denen es sich wahrscheinlich um Provakuolen handelt, in vivo untersucht. Die Fusionsstellen zwischen Provakuolen und der Vakuole befinden sich wahrscheinlich in der Nähe der Kernhülle. Die Rolle der konservierten Membranbindungskomplexe HOPS und CORVET im vakuolären Transport wurde untersucht. In Arabidopsis vermittelt der HOPS-Komplex den vakuolären Transport vom Golgi über AP-3-Vesikel und vom TGN/EE über MVBs, ähnlich seiner Funktion in Hefe- und Säugetierzellen. CORVET hat eine neue Rolle entwickelt und vermittelt einen pflanzenspezifischen Transportweg vom TGN/EE zur Vakuole. Eine Population der am Tonoplasten lokalisierten V-ATPase und V-PPase tritt in einen Golgi-abhängigen Weg ein, der über das TGN/EE und RAB5-positive LEs verläuft, die den CORVET-Membranbindungskomplex für die Fusion mit der Vakuole benötigen. Allerdings scheinen weder der HOPS- noch der CORVET-Komplex eine Rolle bei der Membranfusion zwischen Provakuolen und der Vakuole zu spielen. Tonoplasten-lokalisierte Protonenpumpen können sowohl in Provakuolen als auch in COPII-Vesikel sortiert werden. Dadurch können Protonenpumpen, die am Tonoplasten lokalisiert sind, das ER über zwei verschiedene Wege verlassen, und die Verteilung zwischen den beiden Transportwegen könnte an Umwelt- oder Entwicklungsfaktoren angepasst werden. In meristematischen Wurzelzellen besteht die Vakuole aus einem einzigen, schlauchförmigen Netzwerk, dessen Integrität durch den HOPS-Komplex aufrechterhalten wird. Die homotypische Vakuolenfusion erfolgt durch die Bildung von Vertexringen. Anders als in Hefezellen ist die V-ATPase für die homotypische Vakuolenfusion nicht erforderlich. Das Gleichgewicht des signalgebenden Lipids PI3P an der Vakuolenmembran ist jedoch entscheidend für die ordnungsgemäße Fusion an der Vakuole.