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Abstract

In African trypanosomes, detoxification of lipid hydroperoxides is achieved by three virtually identical non-selenium glutathione peroxidase (Px)-type enzymes which obtain their reducing equivalents from the unique trypanothione/tryparedoxin system. Previous knockout studies in bloodstream Trypanosoma brucei revealed that the two cytosolic Px I and II are essential in contrast to the mitochondrial Px III. Parasites lacking Px I and II are fully viable in the presence of Trolox, but show severe lipid peroxidation and lysis when the vitamin E analog is removed from the medium. Here, I showed that the underlying mechanism is an iron-induced damage of the lysosome. Live cell imaging and immunofluorescence analysis of px I-II knockout cells displayed the progressive loss of different lysosomal signals upon withdrawal of Trolox. In addition, staining of the lysosomal membrane protein p67 was lost prior to the MitoTracker Red signal in accordance with lysosomal disintegration preceding damage of the mitochondrion. Lysis of the px I-II knockout cells was accelerated by supplementing the medium with iron and transferrin whereas it was slowed down in the presence of apo-transferrin and the iron chelator deferoxamine. These data demonstrated that the lethal phenotype was linked to the high-efficiency endocytic iron acquisition of bloodstream trypanosomes. In contrast, generation and phenotypic analyses of procyclic cells lacking either the cytosolic, the mitochondrial or all three enzymes revealed that in the insect form, the cytosolic or the mitochondrial peroxidase is sufficient for cell viability and proliferation whereas the knockout of the whole px locus resulted in cells that require the presence of Trolox. The phenotype was also linked to the iron metabolism of the parasite. Deferoxamine in the medium protected the cells from lysis but starch-coupled deferoxamine − residing in the endosomal/lysosomal compartments − displayed almost no protection. Immunofluorescence microscopy with MitoTracker and antibodies against the glycosomal aldolase and the lysosomal p67 revealed that mitochondrial damage precedes that of the other organelles. Indeed, in procyclic parasites, the mitochondrion seems to be the primary site of intracellular oxidative injury. The distinct mechanisms for the acquisition and metabolism of iron can explain the different phenotypes observed upon deletion of the Px-type enzymes in the infective and insect stage of T. brucei.

Translation of abstract (German)

In afrikanischen Trypanosomen erfolgt die Entgiftung von Lipidhydroperoxiden durch drei nahezu identische nicht-selenhaltige Glutathionperoxidasen (Px), welche ihre Reduktionsäquivalente von dem einzigartigen Trypanothion/Tryparedoxin-System erhalten. Aus vorherigen Knockout-Studien an Trypanosoma brucei Blutstromformen ist bekannt, dass die zytosolischen Px I und II, nicht aber die mitochondriale Px III, essentiell sind. Px I-II-defiziente Parasiten sind in Gegenwart von Trolox lebensfähig, zeigen aber starke Lipidperoxidation und Lyse, wenn das Vitamin E-Analogon aus dem Medium entfernt wird. Ich konnte nachweisen, dass der zugrunde liegende Mechanismus auf einem Eisen-induzierten Schaden des Lysosoms beruht. Lebendzell- und Immunfluorezenz-Analysen der Px I-II-defizienten Zellen offenbarten den zunehmenden Verlust verschiedener lysosomaler Signale nach Entfernen von Trolox. Außerdem verschwand die Anfärbung des lysosomalen Membranproteins p67 vor dem MitoTracker Red-Signal, das heißt, die Auflösung des Lysosoms geht der mitochondrialen Schädigung voraus. Die Lyse der Px I-II-defizienten Zellen wurde durch exogene Zugabe von Eisen oder Transferrin beschleunigt, wohingegen sie in Gegenwart von Apotransferrin oder dem Eisenchelator Deferoxamin verlangsamt wurde. Diese Ergebnisse zeigten, dass der lethale Phänotyp mit der hoch-effizienten endozytotischen Eisenaufnahme der Blutstrom-Trypanosomen verknüft ist. Im Gegensatz dazu ergab die Erschaffung und phänotypische Analyse prozyklischer Zelllinien, in denen entweder die zytosolischen, das mitochondriale oder alle drei Enzyme deletiert waren, dass in der Insektenform die zytosolische oder die mitochondriale Peroxidase für die Lebensfähigkeit und Proliferation ausreichend ist, wohingehend der Knockout des kompletten px-Lokus zu Zellen führte, die Trolox benötigen. Der Phänotyp war auch hier mit dem parasitären Eisenmetabolismus verknüpft. Deferoxamin im Medium schützte die Px I-II-defizienten Zellen vor Lyse, wogegen Stärke-gekoppeltes Deferoxamin, welches in endosomalen bzw. lysosomalen Kompartimenten verbleibt, kaum Schutz bot. Die Immunfluoreszenz mit MitoTracker und Antikörpern gegen die glykosomale Aldolase und das lysosomale p67 machte deutlich, dass die mitochondriale Veränderung anderen Organellschäden vorausgeht. In der Tat scheint in prozyklischen Parasiten das Mitochondrium der primäre Ort von intrazellulärem oxidativem Schaden zu sein. Die unterschiedlichen Mechanismen der Aufnahme und des Stoffwechsels von Eisen erklären die verschiedenen Phänotypen bei Deletion der individuellen Peroxidasen in der infektiösen Blutstrom- bzw. der Insektenform von T. brucei.