German Title: Zentromer-assoziierten RNAs in Drosophila melanogaster

Preview

PDF, English Download (8MB) | Terms of use

Abstract

The centromere is an essential locus for chromosome segregation. It serves as a platform for kinetochore assembly and subsequent spindle microtubule attachment during cell division. Histone H3 variant CENP-A, or CID in Drosophila, is incorporated into centromeric chromatin to epigenetically mark its location. To maintain the centromere, new CID-containing nucleosomes are loaded by the chaperone Cal1, and targeted to the centromere by the inner kinetochore protein CENP-C. Even though centromeres are epigenetically defined and thus independent of the underlying DNA sequences, most are localized on repetitive DNA. In Drosophila, the centromere of each chromosome has a unique combination of transposable elements (TEs), flanked by both simple and complex satellite repeats. In all eukaryotes studied so far, centromeric transcription and the derived centromeric RNAs (cenRNAs) seem to be a structural or regulatory component of the centromere. In Drosophila, the (peri)centromeric RNA SATIII is a part of centromeric chromatin and important for CID loading. Due to the wide variety of repeats and TEs present at Drosophila centromeric DNA, it is likely that we do not have the full picture of the RNAs that are associated with centromeres. Therefore, I set out to identify all centromere-associated RNAs using RNA chromatin immunoprecipitation followed by deep sequencing (RNA-ChIP-seq) in embryos. RNAs from several TEs were enriched in this centromeric pull down, most significantly gypsy element Blastopia. I validated the centromeric localization of Blastopia with single molecule RNA fluorescent in situ hybridization (smRNA-FISH), but was unable to observe pronounced mitotic defects after knockdown. Additionally, I set out to identify which of the factors involved in the CID loading machinery are RNA-binding proteins. Using an RNA-protein complex isolation method called XRNAX, I showed that Cal1 and CID, but not CENP-C, directly bind RNA in S2 cells. By sequencing the RNAs linked to Cal1, I identified the centromere-associated TE Copia as the interaction RNA of Cal1. smRNA-FISH confirmed the presence of Copia at centromeres. Taken together, I identified novel centromere-associated RNAs as a structural or regulatory component of centromeric chromatin, some of which directly interact with the key centromeric protein Cal1.

Translation of abstract (German)

Das Zentromer ist ein wesentlicher Ort für die Chromosomentrennung. Es dient als Plattform für den Aufbau des Kinetochors und die anschließende Befestigung der Spindelmikrotubuli während der Zellteilung. Die Histon H3-Variante CENP-A, in Drosophila CID genannt, wird in das zentromerische Chromatin eingebaut, um dessen Position epigenetisch zu markieren. Um das Zentromer zu erhalten, werden neue CID-haltige Nukleosomen durch das Chaperon Cal1 auf die DNA geladen und durch das innere Kinetochorprotein CENP-C zum Zentromer gelenkt. Obwohl Zentromere epigenetisch definiert und somit unabhängig von den zugrunde liegenden DNA-Sequenzen sind, befinden sich die meisten auf repetitiver DNA. Bei Drosophila weist das Zentromer jedes Chromosoms eine einzigartige Kombination von Transponiblen Elementen (TEs) auf, die sowohl von einfachen als auch komplexen Satelliten-DNA-Sequenzen flankiert werden. In allen bisher untersuchten Eukaryonten scheinen die zentromerische Transkription und die daraus entstehenden zentromerischen RNAs (cenRNAs) eine strukturelle oder regulatorische Komponente des Zentromers zu sein. In Drosophila ist die (peri)zentromerische RNA SATIII ein Teil des zentromerischen Chromatins und wichtig für die CID-Ladung. Aufgrund der großen Vielfalt an repetitiven Sequenzen und TEs, die in der zentromerischen DNA von Drosophila vorkommen, ist es wahrscheinlich, dass wir kein vollständiges Bild von den RNAs haben, die mit Zentromeren verbunden sind. Daher hab ich in dieser Arbeit das Ziel verfolgt, alle Zentromer-assoziierten RNAs mit Hilfe einer RNA-Chromatin-Immunpräzipitation gefolgt von tiefer Next-Generation Sequenzierung (RNA-ChIP-seq) in Drosophila Embryonen zu identifizieren. RNAs von mehreren TEs wurden in dieser zentromerischen Fällung angereichert, vor allem vom Gypsy-Element Blastopia. Ich validierte die zentromerische Lokalisierung von Blastopia mit Einzelmolekül-RNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (smRNA-FISH), konnte aber nach Verringerung der RNA mittels Knockdown keine ausgeprägten mitotischen Defekte beobachten. Des Weiteren wollte ich herausfinden, welche der Faktoren, die an der CID-Lademaschinerie beteiligt sind, RNA-bindende Proteine sind. Mithilfe einer RNA-Protein-Komplex-Isolierungsmethode namens XRNAX konnte ich zeigen, dass Cal1 und CID, nicht aber CENP-C, in S2-Zellen direkt RNA binden. Durch Sequenzierung der mit Cal1 verknüpften RNAs identifizierte ich das Zentromer-assoziierte TE Copia als Interaktions-RNA von Cal1. smRNA-FISH bestätigte das Vorhandensein von Copia an Zentromeren.