German Title: Charakterisierung von an der Thermoregulation beteiligten Zellpopulationen im präoptischen Bereich der Maus

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Abstract

Thermoregulation is a dynamic homeostatic process, tightly regulated by the autonomic nervous system. How the brain coordinates maintenance of the body temperature within a narrow range of 37˚C, a condition that is needed for the survival of most of the species, remains unclear. Among the brain regions implicated in thermoregulation is the anterior portion of the hypothalamus, the preoptic area (POA). In this region neurons that respond to direct temperature stimuli and to the skin and spinal cord warming were found, suggesting that these warm-sensitive neurons (WSNs), are the cells that detect deep brain temperature and integrate it with temperature information from the periphery. The limiting factor in studying the WSNs of the POA and their role in thermoregulation is the lack of specific molecular markers that identify them. Therefore, the goal of this thesis work was to characterize WSNs of the POA at the molecular level and to find their genetic marker(s). To achieve this goal I used a primary POA cell culture and performed calcium imaging while applying a temperature stimulus of 45˚C in the presence and the absence of the TRPM2 antagonist, 2-Aminoethoxydiphenyl borate (2-APB). I identified and hand-picked temperature responding cells and temperature non-responding cells for the single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq). Analysis of the scRNA-seq data pointed to the limitations of the P9 cell culture used. The majority of the temperature non-responding cells expressed glial marker genes together with neuronal markers, a combination not found in vivo. I concluded that the genetic heterogeneity of the sequenced cells was too large and putative WSNs’ molecular markers identified from cultured neurons would be ambiguous. In addition, to find markers of WNSs one has to take another approach, such as Patch-seq to analyze these neurons in more natural conditions. One of the POA neuronal populations activated by a change in ambient temperature is expressing leptin receptor (POALepR). These neurons also exhibit an increase in action potential firing frequency (AP FF) during the process of chronic heat exposure to 36˚C that also leads to an increased heat endurance (at 39˚C). in mice. This intrinsic property of neurons (not affected by synaptic blockers), seems to be needed for a mouse to endure heat, as the animals in which the firing of POALepR is abolished fail to do so. To learn more about the role of the POALepR neurons in the heat acclimation process I used FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting) to isolate the POALepR neurons from POA of non-acclimated and acclimated ( 5 and 30 days at 36 ˚C) LeprCreHTB mice and performed RNA sequencing. I identified three genes Kcnq2, Kcnn2, and Kcnh2, all three coding for potassium ion channels, whose expression level changed with the course of heat acclimation. I have tested the functionality of these ion channels in AP viii firing of the POALepR neurons, by employing electrophysiology and pharmacology in acute POA slices. Ion channels Kv7.2 and Kv11.1, coded by Kcnq2, and Kcnh2, respectively, exhibited a role in shaping the AP firing of POALepR neurons. Applying the antagonist of Kv7.2 disrupted harmonious AP firing of POALepR neurons coming from acclimated mice, rendering their membrane potential unsteady and their firing bursty. In addition, the application of the Kv11.1 antagonist increased the AP FF of POALepR neurons even further in the long-term acclimated condition. Heat acclimation is a naturally occurring process happening across mammalian species, including humans. It is important for enduring physical burdens in hotter climates as it leads to the improved function of the thermoregulatory system. It is forthright to hypothesize that the POA, the central regulator of temperature homeostasis, plays a role in heat acclimation. However, knowledge about it is scarce. Knowing which molecules change in POALepR neurons transcriptome to increase firing, and to which other thermoregulatory relays these neurons project will help us understand their role and the role of POA in heat acclimation.

Translation of abstract (German)

Thermoregulation ist ein dynamischer homöostatischer Prozess, der durch das autonome Nervensystem streng reguliert wird. Eine Körpertemperatur im Bereich von 37˚C ist für die normale Funktion aller enzymatischen Reaktionen und zellulären Prozesse erforderlich. Wie das Gehirn die Aufrechterhaltung der Körpertemperatur koordiniert ist bisher jedoch noch unklar. Zu den Hirnregionen, die an der Thermoregulation beteiligt sind, gehört der Hypothalamus, genauer gesagt sein anteriorer Teil, der präoptische Bereich (POA). In dieser Region wurden Neuronen gefunden, die auf direkte Temperaturreize und auf die Erwärmung von Haut und Rückenmark reagieren, was darauf hindeutet, dass diese wärmeempfindlichen Neuronen (WSN) die Zellen sind, die die Temperatur in der Tiefe des Gehirns erkennen und sie mit den Temperaturinformationen aus der Peripherie integrieren. Der limitierende Faktor bei der Untersuchung der WSN des POA und ihrer Rolle bei der Thermoregulation ist das Fehlen spezifischer molekularer Marker, um diese zu identifizieren. Daher war es das Ziel dieser Arbeit, die WSN des POA auf molekularer Ebene zu charakterisieren und ihre genetischen Marker zu finden. Um dieses Ziel zu erreichen, habe ich Kalzium-Imaging Experimente mit primären POA-Zellkulturen durchgeführt. Die Zellen wurden während eines Temperaturreizes von 45˚C in Gegenwart und Abwesenheit des TRPM2-Antagonisten 2- Aminoethoxydiphenylborat (2-APB) vermessen. Des Weiteren, identifizierte und selektierte ich Zellen mittels Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq), welche auf die Temperatur reagierten und Zellen, die nicht auf die Temperatur reagierten. Die Analyse der scRNA-seq-Daten zeigten jedoch die Grenze der verwendeten P9-Zellkultur auf. Die Mehrzahl der sequenzierten Zellen, die nicht auf den Temperaturstimulus reagierten, exprimierten Glia-Markergene zusammen mit neuronalen Markern, eine Kombination, die in vivo nicht vorkommt. Ich kam daher zu dem Schluss, dass die genetische Heterogenität der sequenzierten Zellen zu groß war und dass die molekularen Marker der mutmaßlichen WSN, die aus den kultivierten Neuronen identifiziert würden, mehrdeutig sein würden. Um Marker für WNS zu finden, muss man außerdem einen anderen Ansatz wählen, z. B. Patch-seq, der Elektrophysiologie und Transkriptomik kombiniert, um diese Neuronen unter natürlicheren Bedingungen zu analysieren. Eine der POA-Neuronenpopulationen, die durch eine Veränderung der Umgebungstemperatur aktiviert wird, exprimiert den Leptinrezeptor (POALepR). Diese Neuronen zeigen auch einen Anstieg der Aktionspotenzial-Feuerungsfrequenz (AP FF) während einer chronischen Hitzeexposition bei 36˚C, was bei Mäusen auch zu einer erhöhten Ausdauer führt. Diese intrinsische Eigenschaft der Neuronen scheint x notwendig zu sein, damit Mäuse Hitze aushalten können, da die Tiere, bei denen das Feuern von POALepR abgeschaltet ist, dies nicht tun. Um mehr über die Rolle der POALepR-Neuronen im Prozess der Hitzeakklimatisierung zu erfahren, habe ich mittels FACS (Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung) die POALepR-Neuronen aus POA von nicht akklimatisierten und akklimatisierten (5 und 30 Tage bei 36 ˚C) LeprCreHTB-Mäusen isoliert und eine RNA-Sequenzierung durchgeführt. Ich habe drei Gene Kcnq2, Kcnn2 und Kcnh2 identifiziert, die alle drei für Kalium-Ionenkanäle kodieren und deren Expressionsniveau sich im Verlauf der Wärmeakklimatisierung verändert. Ich habe die Funktionalität dieser Ionenkanäle beim AP-Feuerns der POALepR-Neuronen mit Hilfe der Elektrophysiologie und Pharmakologie in akuten POA-Schnitten getestet. Die Ionenkanäle Kv7.2 und Kv11.1, die von Kcnq2 bzw. Kcnh2 kodiert werden, spielten eine Rolle bei der Gestaltung des AP-Feuerns von POALepR-Neuronen. Die Anwendung des Antagonisten von Kv7.2 störte das harmonische AP-Feuern von POALepR-Neuronen aus akklimatisierten Mäusen, wodurch ihr Membranpotenzial unstetig und ihr Feuern unbeständig statt fand. Darüber hinaus erhöhte die Anwendung des Kv11.1-Antagonisten die AP –Feuerns der POALepR-Neuronen unter den Bedingungen der Langzeitakklimatisierung sogar noch weiter. Die Wärmeakklimatisierung ist ein natürlicher Prozess, der bei allen Säugetierarten, einschließlich des Menschen, vorkommt. Sie ist wichtig, um körperliche Belastungen in wärmeren Klimazonen zu ertragen, da sie zu einer verbesserten Funktion des Thermoregulationssystems führt. Es liegt die Hypothese nahe, dass der POA, der zentrale Regulator der Temperaturhomöostase, eine Rolle bei der Hitzeakklimatisierung spielt. Es gibt jedoch keine direkten Beweise, die dies bestätigen. Wenn wir wissen, welche Moleküle sich im Transkriptom der POALepR-Neuronen verändern, um die Feuerkraft zu erhöhen, und auf welche anderen Thermoregulationsrelais diese Neuronen projizieren, können wir ihre Rolle und die Rolle des POA bei der Hitzeakklimatisierung in Zukunft besser verstehen.