English Title: Transient Glukose-Exposure of the Nematode Caenorhabditis Elegans: A Model for Metabolic Memory in Diabetes Mellitus

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Abstract

Das metabolische Gedächtnis im Diabetes mellitus ist die biochemische Grundlage der Entwicklung diabetischer mikrovaskulärer Langzeitkomplikationen wie der diabetischen Retinopathie, Nephropathie und Neuropathie. Komplexe irreversible Mechanismen können nach einer initialen Episode schlechter Kontrolle der Blutglukose anhaltende zelluläre Veränderungen verursachen, die durch die bisherigen vorwiegend blutglukosesenkenden Therapien nicht rückführbar sind. Ziel dieser Arbeit war es die anhaltenden Auswirkungen transienter Glukose-Exposition (GE) in dem Modellorganismus C. elegans im Vergleich zu persistenter GE zu untersuchen, Effekte im Sinne eines metabolischen Gedächtnisses zu identifizieren und somit die Eignung als Modell für dieses Phänomen zu evaluieren. Transiente Glukose-Exposition konnte im Vergleich zu persistenter GE keine erhöhte Bildung von „Advanced Glycation Endproducts (AGEs)“, einer typischen Veränderung des metabolischen Gedächtnisses induzieren. Allerdings zeigten sich Hinweise auf weitere Veränderungen wie eine erhöhte Bildung von reaktivem oxidativem Stress (ROS) nach transienter, sowie persistenter GE. Protektive Auswirkungen betrafen eine Erhaltung der Motilität im Alterungsprozess durch transiente und persistente GE, sowie eine Lebensverlängerung, die nur durch transiente GE induziert werden konnte. Diese protektiven Effekte könnten im Sinne der Mitohormese erklärt werden, die eine Induktion antioxidativer Systeme nach Stimulation mit ROS beschreibt. Dieser Mechanismus kann den Organismus vor späteren Schäden übermäßiger ROS-Bildung schützen. Im Gegensatz zu weiteren publizierten Studien zur Auswirkung von GE in C. elegans wurden hier sehr hohe Glukosekonzentrationen gewählt um eine Glukotoxizität zu untersuchen. Neben weiteren methodischen Unterschieden könnte das eine Erklärung für die zum Teil unterschiedlichen Ergebnisse liefern. Auf Transkriptomebene zeigte sich die Genexpression multipler Signal- und Stoffwechselwege anhaltend nach transienter GE verändert. Neben gleichgerichteten Mechanismen nach transienter und persistenter GE zeigten sich auch Mechanismen, die nur nach transienter GE anhaltend verändert waren. Komponenten des Insulinrezeptorsignalwegs zeigten sich vermindert, wohingegen Gene des Aminosäurestoffwechsel vermehrt exprimiert wurden, was insgesamt als Hinweise auf eine Insulinresistenz gedeutet werden könnte. Eine verminderte Genexpression endozytotischer Gene in beiden Gruppen könnte in Verbindung mit einem verringerten Recycling des Insulinrezeptors stehen. Weitere gleichgerichtete Genexpression von Signalwegen nach transienter und persistenter GE betraf antioxidative Enzyme sowie einerseits eine Verminderung ribosomaler RNA-Produktion und Reifung, andererseits eine Erhöhung ribosomaler Proteinproduktion. Diese Veränderungen sprechen für eine gestörte, potentiell inhibierte Translation, worauf auch die verminderte Genexpression der proteinprozessierenden Gene im endoplasmatischen Retikulum in beiden Gruppen hindeutet. Einzig nach transienter GE, aber nicht persistenter GE zeigte sich die Genexpression des FoxO- sowie mTOR-Signalweges vermindert, die unter Kontrolle des Insulinrezeptors stehen und einen Einfluss auf antioxidative sowie mitogene Prozesse wie Zellwachstum und –teilung haben. Diese Ergebnisse sollten mittels Untersuchung der Proteinexpression und mechanistischer Studien validiert werden. Sie liefern Hinweise auf neuartige Mechanismen des metabolischen Gedächtnisses, die eine unterschiedliche Regulation abhängig von der Dauer der GE zeigen. Metabolisch konnte unter persistenter GE keine erhöhte Glukosemenge in den C. elegans gemessen werden. Eine Messung des glykolytischen Flux in weiteren Studien könnte den Metabolismus der Glukose weiter entschlüsseln. Aufgrund der hohen GE-Konzentration wurde mittels Mannitol-exposition (ME) die Rolle der Osmose in diesem Modell untersucht. Die verringerte Größe, Länge und Proteingehalt der Nematoden unter GE konnte in gleichem Ausmaß unter ME erreicht werden. Im Gegensatz dazu war der Einfluss auf Lebensspanne und Motilität nicht vollständig über osmotische Mechanismen zu erklären, was auf weitere glukose-spezifische Mechanismen hindeutet. Insgesamt können durch transiente GE anhaltende AGE-unabhängige Effekte in C. elegans induziert werden, deren Mechanismen nicht vollständig geklärt sind. Das Modell des Fadenwurms kann nach den Daten dieser Studie Hinweise zur Aufklärung von frühen, noch nicht charakterisierten Mechanismen des metabolischen Gedächtnisses geben und damit einen wichtigen Beitrag in der weiteren Erforschung diabetischer Komplikationen und deren potenzieller Behandlung leisten. Zur Durchführung der aufwendigen Versuche konnte im Rahmen dieser Arbeit ein Protokoll für die Massenkultur in C. elegans optimiert werden.

Translation of abstract (English)

The “Metabolic Memory” phenomenon in diabetes mellitus is the biochemical foundation of the development of diabetic microvascular long-term complications, such as diabetic retinopathy, nephropathy, and neuropathy. After an initial episode of poor glycemic control these complex irreversible mechanisms can cause long-lasting cellular modifications, which cannot be reversed by application of the currently existing mostly blood-glucose lowering therapies. The aim of this work was to study the long-lasting effects of transient glucose-exposition (GE) in the model organism C. elegans in comparison to persistent GE to identify effects of the “Metabolic Memory” phenomenon and assess the ability of C. elegans as an adequate model. Transient glucose-exposition in comparison to persistent GE did not induce the formation of „Advanced Glycation Endproducts (AGEs)“ a known characteristic of the “Metabolic Memory” phenomenon. Other long-lasting effects were identified such as an increased formation of reactive oxygen species (ROS) upon transient and persistent GE. Protective effects included a restoration of motility in aging upon transient as well as persistent GE, as well as an increased lifespan, but only upon transient GE. These protective effects could be explained with the theory of mitohormesis, which describes an induction of antioxidative systems upon stimulation with ROS. This mechanism can protect the organism against later damages caused by excessive formation of ROS, similar to a vaccination. In contrast to published studies on the effect of GE in C. elegans, the selected glucose concentrations of this study were extremely high to investigate glucotoxicity. Among further methodological differences, this could be an explanation for the partially different results compared to the literatures. On a transcriptomic level, the gene expression of multiple signaling and metabolic pathways was continuously altered upon transient GE. Among similarly altered pathways upon transient and persistent GE, mechanisms exclusively altered upon transient GE could be identified. Components of the insulin receptor pathway were found to be decreased, whereas the amino acid metabolism was increased indicating an involvement of mechanisms of insulin resistance. Endocytotic genes were found to have a decreased gene expression upon both transient and persistent GE, which could be connected to a decreased recycling of the insulin receptor. Further similarly altered gene expression of signaling pathways in both groups was found involving an increased metabolism of antioxidative enzymes, as well as on the one hand a decreased ribosomal RNA production und maturation and on the other hand an increased ribosomal protein production. This regulation points towards a perturbed and potentially inhibited translation in line with a decreased gene expression of genes involved in protein processing in the endoplasmatic reticulum in both groups. Only after transient, but not persistent GE the gene expression of FoxO- as well as the mTOR-pathway was decreased. Both are under control of the insulin receptor influencing antioxidative as well as mitogenic processes such as growth and division of cells. These results should be validated in the future examining the protein expression and performing mechanistic studies. Furthermore they could indicate innovative mechanisms of the “Metabolic Memory” displaying mechanisms dependent on the mode of exposure. Metabolically, persistent GE did not increase the amount of glucose measured in C. elegans. Assessment of glycolytic flux in future studies could further decipher the metabolism of glucose in this modeBecause of high GE concentrations, mannitol-exposition (ME) was used to examine the role of osmotic pressure in this model. The decrease in size, length, and amount of protein of the nematodes upon GE could be replicated using ME. Contrary to these findings, lifespan and motility could only partially be explained by osmotic mechanisms indicating a role of glucose-specific mechanisms. In summary, transient GE induces continuous, AGE-independent effects in C. elegans which mechanisms are not fully understood, yet. This nematode model has the potential to dissect early, not yet characterized mechanisms of the “Metabolic Memory” and with this contribute to further insights into diabetic complications. For the performance of the tedious experiments, a protocol for large-scale culture was established while conducting this study.