German Title: Design und Synthese anionischer und photoaktivierbarer Fluorophore für die optische Nanoskopie

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Abstract

Small-molecule fluorophores have been recognized as efficient fluorescent reporters in the visualisation of living cells by super-resolution fluorescence microscopy. Much of the ongoing research focuses on positively charged fluorophores derived from rhodamine cores, which show good photostability, live cell permeability and brightness, but suffer from undesired off-targeting and accumulation in certain cell compartments, most typically in mitochondria. Furthermore, their derived photoactivatable labels often rely photocleavable caging groups as bulky nitrobenzene-type groups or α-diazoketones, which may generate toxic or non-fluorescent by-products. Negatively charged fluorophores derived from fluorescein present a valuable alternative with no off-targeting and accumulation. Fluorescein, one of the oldest synthetic fluorophores, is a brightly emitting fluorophore, but suffer from low photostability and cell membrane-impermeability compared to rhodamines. Therefore, the rational design of negatively charged small-molecule fluorophores with improved photostability and cell membrane-permeability is desired. Furthermore, photoactivatable fluorescein analogs may rely on photocleavable groups less bulky than the nitrobenzene-types, which favor the generation of non-toxic by-products, and hence useful for super-resolution microscopy. Within this thesis, the chemical design and synthetic methods to access these fluorophores are discussed and the photophysical properties and application in live-cell super- resolution fluorescence microscopy examined. As a result of this work, N-cyanorhodamines have been identified as bathochromically shifted fluorescein analogs with improved photostability and cell-permeability. Three different synthetic methods have been developed to access these fluorophores from known aryl triflates or iodides. Unlike tetramethylrhodamine, N-cyanorhodamines demonstrate no off-targeting affinity. Based on these fluorophores, fluorescent ligands for self-labeling protein tags HaloTag and SNAP-tag have been prepared and applied in combination with commercially available labels in multi-color confocal and stimulated emission depletion microscopy. The second part of this thesis explores several different strategies to access photoactivatable fluorescein analogs bearing no or smallest possible photocleavable group. Protection of negatively charged fluorophores with photocleavable groups resulted in Ntetrazinylrhodamines and mercaptofluorans as unstable or non-photoactivatable compounds. On the other hand, a synthetic route towards 3,6-dihydroxyxanthones on previously described caging-group-free photoactivatable PaX dyes has been established. Efficient photoactivation of these compounds indicated their potential for future application in single-molecule localisation imaging and as enzymatic sensor activity probes. In conclusion, it was demonstrated that negatively charged fluorescein analogs represents a valuable addition to the toolkit of live cell-compatible fluorescent dyes. Within this work, N-cyanorhodamines as highly photostable and cell membrane-permeable fluorescein derivatives and hydroxy analogs of PaX dyes as photoactivatable analogs of fluoresceins have been prepared. The application of such dyes as fluorophores in live cell imaging has been demonstrated.

Translation of abstract (German)

Fluoreszente Molekülen bieten effiziente Fluoreszenzmarker für die optische Nanoskopie und Visualisierung lebender Zellen. Die Entwicklung neuartiger Fluoreszenzfarbstoffe fokussiert sich primär auf positiv geladene Rhodamine. Diese zeichnen sich durch hohe Photostabilität, Zellpermeabilität und Helligkeit aus. Dem gegenüber weisen sie Fluoreszenzartefakte auf und akkumulieren in Zellregionen wie den Mitochondrien. Des Weiteren basieren photoaktivierbare Rhodamine zumeist auf sterisch anspruchsvollen Nitrobenzol oder α-Diazoketonverbindungen, welche toxische oder nicht fluoreszente Nebenprodukte bilden. Negativ geladene Fluoresceinderivate stellen eine mögliche Alternative dar um Fluoreszenzartefakte und Akkumulieren in Zellregionen vorzubeugen. Fluorescein, eins der ältesten synthetischen Fluorophore, weißt hohe Helligkeit, aber auch geringe Photostabilität und Zellpermeabilität im Vergleich zu Rhodaminen auf. Hierbei kann das rationale Design von Fluoreszenzmolekülen negativ geladene Fluorophore mit erhöhter Photostabilität und Zellpermeabilität hervorbringen. Desweiteren vermögen negativ geladene, photoaktivierbare Fluorophore, die nicht auf sterisch anspruchsvolle Gruppen wie Nitrobenzolen basieren, potentiel nicht-toxische Photoprodukte zu erzeugen. Im Rahmen dieser Thesis werden Fluoresceinderivate in Hinblick auf ihre chemische Darstellung, ihre photophysiklaischen Eigenschaften und ihre Anwendbarkeit in der optischen Nanoskopie an lebenden Zellen evaluiert. Der erste Teil dieser Thesis beschreibt die Entwicklung von N-Cyanorhodaminen. Die bathocrom verschobenen Fluoresceinderivate zeichnen sich durch erhöhte Photostabilität und Zellpermabilität aus und Abwesenheit von Fluoreszenzartefakten aus. Ausgehend von Aryltriflaten wurden verschiedene Syntheserouten entwickelt und Konjugate zu dem HaloTag-Ligand dargestellt. Diese wurden erfolgreich mit kommerziell erhältlichen Fluoreszenzmarkern eingesetzt, um Strukturen lebender Zellen mit Konfokalund STED Mikroskopie zu beobachten. Der zweite Teil dieser Thesis evaluiert verschiedene Strategien in der Darstellung photoaktivierbarer Fluoresceinderivate. N-Tetrazinylrhodamine und Mercaptofluorane wurden als negativ geladene, photoaktivierbare Fluorophore entwickelt. Allerdings erwiesen sich diese Verbindungen als inert zu Licht oder generell instabil. Des Weiteren wurden 3,6-Dihydroxyxanthone basierend auf zuvor beschriebenen PaX Verbindungen dargestellt. Diese Verbindungen sind photoaktivierbar und zeigen eine potentielle Anwendbarkeit in der optischen Nanoskopie Mikroskopie sowie als photoaktivierbare Sensorproben. Zusammengefasst stellen negativ geladene Fluoresceinderivate eine interessante Alternative zu den etablierten und positiv geladene Rhodaminen dar. Im Rahmen dieser Thesis haben dabei N-Cyanorhodamine und neuartige PaX-Derivate ihrer Anwendbarkeit in der Fluoreszenzmikroskopie lebender Zellen demonstriert.