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Abstract

Fibroblast growth factor 2 (FGF2) is a potent mitogen involved in angiogenesis and tumor cell survival. Although a secretory protein involved in autocrine and paracrine signaling, FGF2 does not contain a signal peptide and bypasses the classical ER-Golgi-dependent route of protein secretion. In fact, FGF2 is secreted unconventionally (type I UPS) via direct translocation across the plasma membrane by self-sustained pores. FGF2 is recruited to the plasma membrane via interaction with the ⍺1 subunit of the Na,K-ATPase. Thereafter FGF2 interacts with Tec kinase, which phosphorylates FGF2. FGF2 binds to the phosphoinositide PI(4,5)P2, which drives its dimerization and oligomerization into membrane-spanning complexes. FGF2 is then captured on the cell surface through binding to heparan sulfate proteoglycans (HSPGs). The GPI-anchored HSPG glypican-1 (GPC1) was identified in our laboratory via a genome-wide BioID screen. In the here presented thesis, GPC1 CRISPR-Cas9 knockout (KO) cell lines were shown to secrete significantly less FGF2 in cell surface biotinylation assays. GPC1 reintroduction and stable overexpression did not only restore secretion to wild-type levels but even further increased secretion. FGF2 endocytosis was not affected by GPC1 KO or overexpression. As I could correlate GPC1 levels to FGF2 secretion in TIRF microscopy, GPC1 can be considered a rate-limiting factor for FGF2 secretion. GPC5, another endogenously expressed glypican in HeLa cells, did not reduce FGF2 secretion when knocked out. Also, GPC5 could not compensate for loss of GPC1 in the here demonstrated data. GPC6 knockout in U2OS cells only led to a modest decrease in FGF2 secretion, yet further decreased FGF2 secretion in GPC1 KO cells in my experiments. Organization of FGF2 and the components needed for secretion into nanodomains would facilitate fast FGF2 secretion from cells. FGF2, ⍺1 and GPC1 were indeed shown to be in proximity to each other in the here conducted proximity ligation assays. Also, I found all three components in detergent resistant membrane (DRM) fractions, whereby GPC1 was the determining factor for FGF2 DRM localization. Super resolution STED experiments showed a homogenous distribution of ⍺1 and GPC1 throughout the membrane. Interestingly, I found FGF2 and PI(4,5)P2 in areas enriched in cholesterol detected via EGFP-Gram1b G187L transfection, which is supported by recent findings demonstrating that cholesterol promotes FGF2 secretion. Caveolins, cholesterol-binding proteins that assemble into detergent resistant membrane fractions, were analyzed regarding their effect on FGF2 secretion. In my experiments caveolin-1 (Cav1) and -2 (Cav2) affected FGF2 secretion in HeLa S3 and U2OS. In HeLa cells, caveolin-2 KO cells showed reduced FGF2 secretion in biotinylation experiments. Intriguingly, caveolin-1 failed to localize into DRM fractions in this context and also ⍺1 and FGF2 levels were reduced in liquid ordered detergent resistant fractions. Cav2 KO in U2OS on the other hand, did not impact FGF2 secretion in my hands, although TIRF data demonstrated Cav1 to be involved in FGF2 secretion. Caveolin function in FGF2 nanodomain organization remained unresolved. Pulldown experiments I conducted using trifunctional lipid probes demonstrated an interaction between PI(3,4,5)P3 and the ⍺1 subunit of the Na,K-ATPase, further supporting the hypothesis of specialized membrane domains involved in FGF2 membrane translocation into the extracellular space.

Translation of abstract (German)

Der Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF2) ist ein potentes Mitogen, welches an der Angiogenese und dem Überleben von Tumorzellen beteiligt ist. Obwohl FGF2 ein sekretorisches Protein ist, das an der autokrinen und parakrinen Signalübertragung beteiligt ist, enthält es kein Signalpeptid und umgeht den klassischen ER-Golgi-abhängigen Weg der Proteinsekretion. Tatsächlich wird FGF2 unkonventionell (Typ I UPS) durch direkte Translokation durch autarke Poren sezerniert. FGF2 wird durch die ⍺1-Untereinheit der Na,K-ATPase an die Plasmamembran rekrutiert. Danach interagiert FGF2 mit Tec-Kinase, die FGF2 phosphoryliert. FGF2 bindet an das Phosphoinositid PI(4,5)P2, das seine Oligomerisierung zu membrandurchspannenden Komplexen vorantreibt. FGF2 wird dann auf der Zelloberfläche durch Bindung an Heparansulfat-Proteoglykane (HSPG) eingefangen. Das GPI-verankerte HSPG Glypican-1 (GPC1) wurde in unserem Labor über einen genomweiten BioID-Screen identifiziert. In der hier vorgestellten Arbeit wurde gezeigt, dass GPC1 CRISPR-Cas9 Knockout (KO) Zelllinien signifikant weniger FGF2 in Zelloberflächen-Biotinylierungsassays sezernieren. Die Wiedereinführung von GPC1 stellte nicht nur die Sekretion auf das Wildtypniveau wieder her, sondern erhöhte die Sekretion sogar noch weiter. Die FGF2-Endozytose wurde hingegen nicht beeinflusst. Da ich die GPC1-Spiegel mit der FGF2-Sekretion in der TIRF-Mikroskopie korrelieren konnte, kann GPC1 als geschwindigkeitsbegrenzender Faktor für die FGF2-Sekretion angesehen werden. GPC5, ein weiteres endogen exprimiertes Glypican in HeLa-Zellen, beeinflusste die FGF2-Sekretion nicht. GPC5 konnte den Verlust von GPC1 in den hier gezeigten Daten nicht kompensieren. GPC6-Knockout in U2OS-Zellen führte in meinen Experimenten nur zu einer bescheidenen Abnahme der FGF2-Sekretion, jedoch zu einer weiteren Abnahme der FGF2-Sekretion in GPC1-KO-Zellen. Die Organisation von FGF2 und den für die Sekretion benötigten Komponenten in Nanodomänen würde eine schnelle FGF2-Sekretion aus Zellen erleichtern. In den hier durchgeführten PLA („proximity ligation assay“) Experimenten wurde gezeigt, dass FGF2, ⍺1 und GPC1 nahe beieinander liegen. Außerdem fand ich alle drei Komponenten in Fraktionen mit Detergens-resistenten Membranen (DRM), wobei GPC1 der bestimmende Faktor für die Lokalisierung von FGF2 in DRM-Fraktionen war. STED-Experimente zeigten eine homogene Verteilung von ⍺1 und GPC1 über die gesamte Membran. Interessanterweise fand ich FGF2 und PI(4,5)P2 in Bereichen, die mit Cholesterin angereichert waren, nachgewiesen durch EGFP-Gram1b G187L-Transfektion, was durch neuere Erkenntnisse gestützt wird, die zeigen, dass Cholesterin die FGF2-Sekretion fördert. Caveoline, cholesterinbindende Proteine, die sich zu Detergens-resistenten Membranfraktionen zusammenlagern, wurden hinsichtlich ihrer Wirkung auf die FGF2-Sekretion analysiert. In meinen Experimenten beeinflussten Caveolin-1 (Cav1) und -2 (Cav2) die FGF2-Sekretion in HeLa S3- und U2OS-Zellen. In HeLa-Zellen zeigten Caveolin-2 KO-Zellen in Biotinylierungsexperimenten eine reduzierte FGF2-Sekretion. Interessanterweise gelang es Caveolin-1 in diesem Zusammenhang nicht, sich in DRM-Fraktionen zu lokalisieren, und auch die ⍺1- und FGF2-Level waren in Detergens-resistenten Fraktionen reduziert. Cav2 KO in U2OS hingegen hatte keinen Einfluss auf die FGF2-Sekretion in meinen Händen, obwohl TIRF-Daten zeigten, dass Cav1 an der FGF2-Sekretion beteiligt war. Die Caveolin-Funktion bei der Organisation von FGF2-Nanodomänen blieb ungelöst. Pulldown Experimente mit trifunktionellen Lipidproben haben eine spezifische Interaktion zwischen ⍺1 und PI(3,4,5)P3 nachgewiesen. Dies unterstützt die Hypothese von organisierten Membrandomänen die auf die FGF2-Sekretion spezialisiert sind.