Preview

PDF, English Download (4MB) | Terms of use

Abstract

Abstract The biotechnology industry is growing rapidly and is embedded in a highly regulated and dynamic environment. Under the regulations and guidelines of the Food and Drug Association, short FDA, a pharmaceutical company must ensure the quality of biotechnological products. Within the last few years so called in-line technologies revolutionized the batch production procedure in the biopharmaceutical industry towards continuous manufacturing and real-time monitoring of critical vitality parameters in a bioreactor. As a key benefit, it is expected that with this technology, final product deviations can be reduced by up to 50%. Furthermore, studies have been shown that regulating vitality parameters such as glucose can improve overall product quality. Despite the increasing adoption and expected doubling of the market in the next years, there are challenges. Continuous manufacturing methods are not yet well characterized for therapeutic proteins due to a lack of (bio-)analytical in-line technology. The overall objective of this work was to develop optical glucose biosensor recognition elements that can measure ‘in-line’ physiological glucose concentrations. For that purpose, the well-researched glucose-galactose binding protein in E. coli (GGBP) was genetically and chemically modified to enhance the spectral properties of the biosensing element. Several single-labelled as well as self-calibrated dual-labelled systems were developed. The candidate proteins were designed, synthesized, and labelled with commercially available fluorophores. The best result for the single-labelled glucose sensing system was achieved with the combination of GGBP variant H152C/A213R/L238S labelled with the newly developed commercially available dye Atto 465. A linear dependency between 1-75 mM glucose with a total fluorescence increase of +48% could be demonstrated. Furthermore, this work presents for the first time, selective labeling of FRET-based biosensor recognition elements based on the recently discovered π-clamp strategy (Nature Chem., 2016). For this purpose, a chemical synthesis of perfluoro arylated fluorophore (XC113) has been developed. It could be shown that dual labeling of a FRET pair was highly accurate and selective. GGBP variant H152C/A213R/L238S_DGTN280-283FCPF labeled with XC113 and DY585 proved the idea of the concept and a successful labeling of the pi-clamp. A fluorescence transfer rate of 18% was obtained and a maximal fluorescence intensity change by 12% upon binding of glucose was observed. In a future experiment, this mutant can be further improved by using Atto 495 and DY585 as a FRET pair and an overly sensitive ratiometric glucose biosensor could be developed for bioreactor environments.

Translation of abstract (German)

Zusammenfassung Die Biotechnologie Industrie erfährt in den letzten Jahren ein starkes Wachstum und befindet sich in einem hoch regulierten Umfeld welches durch die FDA, die amerikanische Arzneimittelzulassungsbehörde, kontrolliert wird, um die Qualität von Arzneimitteln zu gewährleisten. In den letzten Jahren haben integrierte analytische Verfahren die Batch Produktion revolutioniert und den Weg zu kontinuierlichen Produktionsverfahren mit Echtzeitanalytik geebnet. Dabei stellt sich die Reduktion der Produktabweichungen um potenziell fast 50% als einer die größten Vorteile heraus. Des Weiteren konnte durch Studien gezeigt werden, dass das Regulieren wichtiger Vitalstoffe während des Prozesses wie z.B. der Glukose die gesamte Produktqualität positiv beeinflussen kann. Obwohl das kontinuierliche Verfahren viel Zuspruch findet und sich stark entwickeln wird gibt es dennoch Rückschläge. Für viele therapeutische Proteine ist das kontinuierliche Verfahren noch nicht ausgereift genug, denn es fehlt an integrierbaren (bio-)analytischen Sensorikmethoden. Das Ziel dieser Arbeit war es integrierbare optische Biosensorerkennungselemente zu entwickeln, die es erlauben Glukosekonzentrationen in physiologischen Konzentrationen zu messen. Hierfür wurde das Glucose-Galactose Bindeprotein in E. coli. (GGBP) genetisch verändert und sowohl mit einzelnen umgebungssensitiven Fluoreszenzfarbstoffen als auch mit jeweils einem FRET Paar (zwei selektiv markierte Fluoreszenzfarbstoffe) markiert. Das beste Ergebnis für einen umgebungssensitives Sensorelement wurde durch die GGBP Variante H152C/A213R/L238S und dem neu entwickelten Farbstoff Atto 465 erzielt. Ein linearer Zusammenhang (R2=0.98) konnte für Glucosekonzentration von 1-75 mM mit einer Gesamtfluoreszenzerhöhung von +48% gezeigt werden. Im zweiten Teil dieser Arbeit konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass sich Biosensorelemente mit FRET Paaren mithilfe der kürzlich entdeckten ‚Pi-Clamp Methode‘ (Nature Chem., 2016) sehr einfach hoch selektiv markieren lassen. Dafür wurde eine einfache Syntheseroute entwickelt, um kommerzielle Fluoreszenzfarbstoffe mit perfluorarylierten Linkermolekülen zu koppeln. Die, mit den Farbstoffen XC113 und DY585 markierte GGBP Variante H152C/A213R/L238S_DGTN280-283FCPF konnte eine Glucosesensitivität bis 100 mM mit einer FRET Übertragungsrate von 18% bei einer absoluten Fluoreszenzänderung von +12% beweisen. Aufgrund dieser Ergebnisse könnte gezeigt werden, dass mithilfe von diesem FRET System in einem weiteren Experiment mit dem umgebungssensitiven Farbstoff Atto 495 und dem Fluorophor DY 585 ein noch sensitiveres ratiometrisches Biosensorelement entwickelt werden könnte.