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Abstract

V-ATPases are highly conserved proton pumps that function not only as proton pumps but are involved in many processes through interactions with different proteins. In plant cells, the trans-Golgi network/early endosome (TGN/EE) is a compartment of specific significance, as trafficking pathways converge there. Cargo from secretory, endocytic and recycling trafficking pathways travel through the TGN/EE. Acidification of the TGN/EE is accomplished by V-ATPase complexes with the VHA-a subunit isoform VHA-a1 in Arabidopsis. While V-ATPases which contain VHA-a1 localize to the TGN/EE, V-ATPases with VHA-a2 or VHA-a3 are targeted to the tonoplast, the limiting membrane of the vacuole. This thesis describes the mutant phenotype of the gene encoding the subunit VHA-a1. Strikingly, during vegetative development vha-a1 is wildtype like. It is shown that VHA-a2/VHA-a3-containing V-ATPases can compensate for the lack of VHA-a1 during vegetative growth. Given the subcellular specialization of VHA-a1 versus VHA-a2 and VHA-a3 this is astonishing and represents a striking example of functional redundancy of isoforms despite differential localization. I further show that VHA-a1 is essential for pollen development. VHA-a3-containing V-ATPases are not able to compensate for the lack of VHA-a1 in pollen development. Microspores in the vha-a1 mutant are defective in pollen wall formation. As early as at the tetrad stage, when pollen wall development starts with the formation of the primexine, defects are visible in vha-a1. Rescue experiments with VHA-a1 expressed under the control of different promoters revealed that tapetum-specific expression of VHA-a1 does not rescue pollen development of vha-a1. For the process of primexine formation the results of this work suggest that primexine formation is largely governed by the gametophyte. In addition to the early defect, absence of VHA-a1 leads to a late defect, as seen from the lack of transmission of the mutant allele via the male gametophyte despite at the time of pollen release vha-a1 and wildtype microspores in vha-a1/+ anthers are indistinguishable. Furthermore, the potential capability of pH sensing of the TGN/EE resident V-ATPase in Arabidopsis and the underlying molecular mechanism was analyzed by mutation of VHA-a1 histidine residues. While some VHA-a1 histidine substitution variants were able to rescue the defect in pollen development of vha-a1, others possibly cannot, suggesting that these histidine residues have an essential function. Moreover, this thesis shows that also the V-ATPase-associated VHA-AP1 is essential for the male gametophyte and that its knock-down results in reduced cell expansion.

Translation of abstract (German)

V-ATPasen sind hochkonservierte Protonenpumpen, die nicht nur als Protonenpumpen agieren, sondern durch Interaktionen mit unterschiedlichen Proteinen an vielen Prozessen beteiligt sind. In Pflanzenzellen ist das trans-Golgi Netzwerk/frühe Endosom (TGN/EE) ein Kompartiment von besonderer Bedeutung, da dort unterschiedliche Transportwege aufeinandertreffen. Fracht aus sekretorischen, Endozytose- und Recyclingtransportwegen durchquert das TGN/EE. Das TGN/EE wird von V-ATPase-Komplexen, welche die Untereinheit VHA-a1 besitzen, angesäuert. Während V-ATPasen, die VHA-a1 enthalten, am TGN/EE lokalisiert sind, werden V-ATPasen, die VHA-a2 oder VHA-a3 enthalten, zum Tonoplasten, der vakuolären Membran, transportiert. Diese Arbeit beschreibt den Mutanten-Phänotyp des Gens, das für die Untereinheit VHA-a1 kodiert. Bemerkenswerterweise ist vha-a1 während der vegetativen Entwicklung wildtypähnlich. Es wird gezeigt, dass VHA-a2/VHA-a3-enthaltende V-ATPasen das Fehlen von VHA-a1 während des vegetativen Wachstums ausgleichen können. Angesichts der subzellulären Spezialisierung von VHA-a1 im Vergleich zu VHA-a2 und VHA-a3 ist dies erstaunlich und stellt ein eindrucksvolles Beispiel für die funktionelle Redundanz von Isoformen trotz unterschiedlicher Lokalisierung dar. Darüber hinaus zeige ich, dass VHA-a1 essentiell für die Pollenentwicklung ist. VHA-a3-enthaltende V-ATPasen sind nicht in der Lage, das Fehlen von VHA-a1 in der Pollenentwicklung auszugleichen. Mikrosporen der vha-a1 Mutante sind defekt in der Bildung der Pollenwand. Rettungsexperimente, in denen VHA-a1 unter der Kontrolle unterschiedlicher Promotoren exprimiert wurde, zeigten, dass Tapetum-spezifische Expression von VHA-a1 die Pollenentwicklung von vha-a1 nicht rettet. Für den Prozess der Bildung der Primexine deuten die Ergebnisse dieser Arbeit darauf hin, dass die Bildung der Primexine in großen Teilen vom Gametophyten ausgeht. Zusätzlich zu dem frühen Defekt führt das Fehlen von VHA-a1 zu einem späten Defekt, was die fehlende Übertragung von vha-a1 durch den männlichen Gametophyten zeigt, obwohl zum Zeitpunkt der Pollenfreisetzung vha-a1- und Wildtypmikrosporen in vha-a1/+ Antheren ununterscheidbar sind. Außerdem wurden die mögliche Fähigkeit der pH Wahrnehmung der am TGN/EE lokalisierten V-ATPase, und der zugrundeliegende molekulare Mechanismus, durch Mutation von Histidinen in VHA-a1 analysiert. Während einige der VHA-a1 Histidinmutanten den Defekt in der Pollenentwicklung in vha-a1 retten konnten, sind andere möglicherweise dazu nicht in der Lage, was auf eine essentielle Funktion dieser Histidine hindeutet. Des Weiteren zeigt diese Arbeit, dass auch das mit der V-ATPase assoziierte VHA-AP1 essentiell für den männlichen Gametophyten ist, und dass seine Herunterregulierung zu reduzierter Zellexpansion führt.