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Abstract

The fluorescence-based nanoscopy methods MINFLUX and MINSTED are currently revolutionizing the field of imaging and single molecule tracking by achieving molecular spatial precision with low photon numbers. Using a polymer-based in vitro assay with strongly reduced fluorescence background, I identified MINFLUX-compatible spontaneously blinking fluorophores by quantifying their blinking properties. Due to the spontaneous blinkers being live-cell compatible and having few milliseconds short on-events, I expect them to advance the imaging field by drastically accelerating MINFLUX measurements. The main focus of this work, however, is the application of the nanoscopy methods MINFLUX and MINSTED for tracking of the motor protein kinesin-1. Requiring an only ~1 nm small fluorophore as label, they are inherently less artefact-prone than established techniques which require the attachment of comparatively large beads for a similar spatio-temporal resolution. With an improved interferometric MINFLUX approach, we successfully resolved regular steps and substeps of the kinesin-1 stalk and heads. By discovering that ATP binds to the motor in the one-head-bound state and is hydrolyzed in the two-head-bound state, we aim to solve a long-standing controversy in the field. Furthermore, we deduced that when the rear head of kinesin-1 detaches from the microtubule, it rotates around its front into a rightward-displaced unbound state. In conjunction with an observed stalk rotation, I concluded the motor to walk in a symmetric hand-over-hand fashion. Finally, we successfully resolved the stepping of kinesin-1 with MINSTED, confirming many findings from the MINFLUX experiments and observing motor sidestepping and protofilament switching. These findings will prove helpful in developing treatments for diseases linked to malfunction of kinesins. Beyond that, this thesis establishes MINFLUX and MINSTED for the tracking of dynamic biological processes on the single molecule level.

Translation of abstract (German)

Die fluoreszenzbasierten Nanoskopiemethoden MINFLUX und MINSTED revolutionieren derzeit die Bereiche von Bildgebung und Einzelmolekülverfolgung, indem sie mit geringen Photonenzahlen eine molekulare räumliche Auflösung erreichen. Mit Hilfe eines polymerbasierten in vitro Tests mit stark reduziertem Fluoreszenzhintergrund ermittelte ich MINFLUX-kompatible spontan blinkende Fluorophore, indem ich ihre Blinkeigenschaften quantifizierte. Da die spontanen Blinker mit lebenden Zellen kompatibel sind und kurze Einschaltzeiten von wenigen Millisekunden haben, erwarte ich, dass sie das Forschungsfeld der Bildgebung durch drastisch beschleunigte MINFLUX-Messungen voranbringen werden. Der Hauptfokus dieser Arbeit ist jedoch die Anwendung der Nanoskopiemethoden MINFLUX und MINSTED für die Einzelmolekülverfolgung des Motorproteins Kinesin-1. Indem sie nur einen ~1 nm kleinen Fluoreszenzfarbstoff als Markierung benötigen, sind sie von Natur aus weniger anfällig, Messartefakte zu erzeugen, als etablierte Techniken, die für eine ähnliche räumlich-zeitliche Auflösung das Anbringen eines vergleichsweise großen Kügelchens voraussetzen. Mit einem verbesserten interferometrischen MINFLUX-Ansatz gelang es uns, sowohl regelmäßige Schritte als auch Teilschritte des Stiels und der Köpfe von Kinesin-1 aufzulösen. Durch die Entdeckung, dass ATP bindet, wenn nur einer der Köpfe gebunden ist, und hydrolysiert wird, wenn beide Köpfe gebunden sind, versuchen wir, eine seit langem bestehende Kontroverse des Forschungsfeldes zu lösen. Darüber hinaus fanden wir heraus, dass sich der hintere Kopf von Kinesin-1, nachdem er sich vom Mikrotubulus abgelöst hat, um seine Vorderseite dreht und in einen nach rechts verschobenen, ungebundenen Zustand übergeht. In Verbindung mit der beobachteten Rotation des Stiels folgerte ich, dass der Motor in einer symmetrischen Hand-über-Hand-Weise läuft. Abschließend gelang es uns, das Laufverhalten von Kinesin-1 mit MINSTED zu untersuchen, wobei wir viele Ergebnisse der MINFLUX-Experimente bestätigen und das Ausweichen des Motors und Protofilamentwechsel beobachten konnten. Diese Erkenntnisse werden bei der Entwicklung von Therapien für Krankheiten, die durch eine Fehlfunktion von Kinesinen verursacht werden, hilfreich sein. Vor allem jedoch etabliert diese Arbeit MINFLUX und MINSTED für die Verfolgung dynamischer biologischer Prozesse auf der Ebene einzelner Moleküle.