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PDF, English - main document Download (47MB) | Lizenz: Biochemical and molecular characterisation of the transcription factor WUSCHEL in Arabidopsis thaliana by Lampropoulos, Athanasios underlies the terms of Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0

Abstract

Plants are autotroph sessile organisms that are characterised by extensive postembry- onic development. This continuous generation of new tissues and organs, which follows the germination of the plant embryo, is driven by multipotent stem cells that reside in special- ized tissues called meristems. The Shoot Apical Meristem (SAM) is the tissue where almost all aerial plant organs are generated. In the eudicot reference plant Arabidopsis thaliana, the stem cell pool of the SAM is located in the Central Zone (CZ) and is maintained by the cells of the adjacent Organising Centre (OC). The latter express the homeodomain transcrip- tion factor WUSCHEL (WUS), which is the key regulator of stem cell function in the SAM. WUS moves from the OC into the CZ through the plasmodesmata where it upregulates or represses its target genes. CLAVATA3 (CLV3), a gene activated by WUS in the CZ, encodes an oligopeptide that is secreted in the apoplastic space and subsequently moves back to the OC where it represses WUS, thereby establishing a negative feedback loop that controls stem cell fate. The biological functions of WUS cannot be fully explained yet. However, it is known that WUS exerts its role in the SAM via physical interaction with other proteins. WUS acts as negative regulator of gene expression for a multitude of genes and this function is enhanced by its interaction with the transcriptional repressor TOPLESS (TPL). In addition, the interac- tion of WUS with transcription factor HAIRY MERISTEM 1 (HAM1) is a prerequisite for the spatially correct activation of CLV3 by WUS in the SAM. Therefore, I decided to ascertain the in vivo WUS complex with the goal of identifying novel WUS interactors in an attempt to elucidate WUS function. To this end, I performed a yeast two-hybrid (Y2H) screening against an extensive library of transcription factors from A. thaliana. The interaction of a subset of these transcription fac- tors with WUS was further validated with Acceptor Photobleaching Förster Resonance En- ergy Transfer (AP-FRET) in planta. Among the candidates that I identified were WOX9 and ESR1, whose genetic interaction with WUS I dissected by means of generating and studying CRISPR mutants for the respective genes. Additionally, I performed co-immunoprecipitation reactions (co-IPs) of WUS fusion proteins that were expressed under the native WUS pro- moter in A. thaliana meristematic tissue or were overexpressed in Nicotiana benthamiana. The WUS complexes that I pulled down were further analysed with Mass Spectrometry. I also studied the effect of WUS phospho-PTMs by expressing the respective phospho-mutants and phospho-mimics in A. thaliana.

Translation of abstract (German)

Pflanzen sind sessile autotrophe Organismen, die sich durch eine extensive postembryo- nale Entwicklung auszeichnen. Die damit verbundene ständige Bildung von neuem Gewebe und neuen Organen, die direkt nach Keimung des Embryos einsetzt, wird dabei von multipo- tenten Stammzellen getrieben, die in speziellen Geweben, den Meristemen, zu finden sind. Das apikale Sprossmeristem ist das Gewebe, in dem fast alle überirdischen Pflanzenorgane ihren Ursprung haben. In Arabidopsis thaliana befindet sich die Population der Stammzellen des Sprossmeristems in der sogenannten zentralen Zone (ZZ), wo sie durch die Aktivität der Zellen des darunter liegenden organisierenden Zentrums (OZ) aufrechterhalten wird. Letzte- re exprimieren den Transkriptionsfaktor WUSCHEL (WUS), bei dem es sich um den entschei- denden Regulator der Stammzellfunktion im Sprossmeristem handelt. WUS wandert durch die Plasmodesmen von den Zellen des OZ in die Zellen der ZZ, wo es die Expression seiner Zielgene hoch- oder runterreguliert. CLAVATA 3 CLV3, ein Gen dessen Expression durch WUS in der zentralen Zone induziert wird, codiert für ein Oligopeptid, das in den Apoplast sekretiert wird und von dort in die Zellen des OZ wandert, wo es die Expression von WUS unterdrückt und somit zur Etablierung eines negativen Feedback-Mechanismus beiträgt, der das Stammzellschicksal im Meristem kontrolliert. Die biologische Funktion von WUS ist noch nicht vollständig aufgeklärt. Es ist jedoch bekannt, dass WUS seine Rolle im Sprossmeristem über die physikalische Interaktion mit anderen Proteinen ausübt. WUS wirkt als negativer Regulator der Genexpression für eine Reihe von Genen und diese Aktivität wird über die Wechselwirkung mit dem transkriptionalen Repressor TOPLESS (TPL) vermittelt. Darüber hinaus ist die Interaktion von WUS mit dem Transkriptionsfaktor HAIRY MERISTEM 1 (HAM1) Voraussetzung für die korrekte räumliche Expression von CLV3 durch WUS im Sprossmeristem. Um neue potentielle WUS Bindepart- ner zu identifizieren, sollten in dieser Arbeit in vivo WUS Proteinkomplex untersucht werden, die möglicherweise zum besseren Verständnis der Funktion von WUS beitragen können. Dazu wurde zunächst ein Yeast two-hybrid Screen mit einer umfangreichen Bibliothek von Transkriptionsfaktoren aus A. thaliana durchgeführt. Interaktionen zwischen WUS und ei- nem Teil der dabei identifizierten Transkriptionsfaktoren konnten anschließend durch Förster Resonanz Energie Transfer in planta bestätigt werden. Unter den so identifizierten Kandida- ten waren WOX9 und ESR1. Um genetische Interaktionen zwischen diesen beiden Genen und WUS zu untersuchen, wurden entsprechende CRISPR Mutanten generiert und ana- lysiert. Zusätzlich wurden co-Immunpräzipitationen mit WUS Fusionsproteinen, die entwe- der unter Kontrolle des nativen WUS Promotors aus A.thaliana Meristemgewebe oder nach Überexpression aus Nicotiana benthamiana Blättern isoliert wurden, durchgeführt. Die da- bei gewonnenen WUS Proteinkomplexe wurden mit Hilfe von Massenspektrometrie weiter analysiert. Zudem wurde der Einfluss von posttranslationalen Phosphor-Modifikationen auf die Funktion von WUS untersucht. Hierzu wurden entsprechende Mutanten generiert und in A. thaliana exprimiert.