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PDF, English - main document Download (71MB) | Lizenz: Development and Evolution of the Mammalian Cerebellum at Single Cell Resolution by Leiß, Kevin underlies the terms of Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0

Abstract

Originally thought to only take part in motor control, the cerebellum emerged over the last decades as an important organ in various higher cognitive functions, such as learning and speech. Besides this, the cerebellum is associated to various diseases, such as spinocerebellar ataxia, autism spectrum disorder, and medulloblastoma. The basic structure and connective properties of it are well understood, but single-cell-technologies made it possible to study the cerebellum at higher resolution. Many questions about molecular details of its development and evolution are still not answered. Cerebella are present in all jawed vertebrates, though structural diversity is macroscopic and microscopic detectable, such as the number of deep nuclei, the presence of the vermis, or the mode of production of one of the most important cell types in the cerebellum - granule cells. Using single-nucleus RNA-sequencing (snRNA-seq) and bioinformatic approaches, I studied cerebellum data of human, mouse (Mus musculus) and opossum (Monodelphis domestica). The dataset contained samples spanning the organs development at high temporal resolution. It was possible to track the differentiation of the major cerebellar neuronal and glial cell types, as well as identify states and subtypes. This generated a comprehensive map of cellular complexity through eutherian (human and mouse) and marsupial (opossum) development. Leveraging the evolutionary distance of approximately 160 million years between the eutherian and marsupial lineage, conserved and diverged cell type marker genes could be identified which might be promising candidates for understanding the basic blueprint of cerebellar cell type identity. Stage correspondence mapping aligned the vastly different developmental time frames of the three studied species and allowed the identification of a two-fold increase in Purkinje cell progenitors in the human lineage, which might be connected to a recently identified human-specific secondary ventricular zone progenitor pool. It was possible to model the differentiation path of granule and Purkinje cells from early progenitors to mature neurons. Conserved and diverged gene expression trajectories were discovered. Using in vitro and in vivo intollerance scores, I could show that genes which are dynamically expressed during differentiation show higher functional constraint as non-dynamic genes, fitting to previous bulk-RNA-seq studies, showing similar results across the development of the full organ. Some orthologs with diverging patterns were disease-associated genes, which could have implications on clinical research on conditions like autism spectrum disorders and medulloblastoma. Furthermore, fundamental changes of gene expressions, established as gain or loss of expression within a cell type and species, were detected. Affected genes showed decreased functional constraint, verifying evolutionary principles on single cell scale. Taken together, this study shows the strength of state of the art methodology combined with high resolution developmental sampling in an evolution biological context to discover fundamental principles of organ development at single-cell scale.

Translation of abstract (German)

Ursprünglich dachte man, dass das Kleinhirn (Cerebellum) nur an motorischer Kontrolle beteiligt ist, aber in den letzten Jahrzenten erkannte man, dass es auch bei der Verarbeitung höherer kognitiver Funktionen wie z.B. Lernen und Sprache beteiligt ist. Außerdem steht das Kleinhirn in Verbindung mit verschiedenen Krankheiten wie der spinozerebellären Ataxie, der Autismus-Spektrum-Störung und dem Medulloblastom, einem pädiatrischen Hirntumor. Die Grundstruktur und die Verbindungseigenschaften des Kleinhirns sind gut verstanden, aber die Einzelzelltechnologien ermöglichten, das Kleinhirn detaillierter zu untersuchen. Viele Fragen zu molekularen Details seiner Entwicklung und Evolution sind noch nicht vollständig beantwortet. Kleinhirne sind bei allen Gnathostomata vorhanden, doch strukturelle Unterschiede sind makroskopisch und mikroskopisch nachweisbar, wie etwa die Anzahl der sogenannten “deep nuclei”, das Vorhandensein der Vermis oder die Produktionsweise eines der wichtigsten Zelltypen im Kleinhirn - den Körnerzellen. Mithilfe der Einzelkern-RNA-Sequenzierung (single-nucleus RNA-seq, snRNA-seq) und bioinformatischer Ansätze habe ich Kleinhirndaten von Mensch, Maus (Mus musculus) und Opossum (Monodelphis domestica) untersucht. Der Datensatz enthielt Proben, die die Entwicklung des Organs in hohe zeitliche Auflösung abbilden. Es war möglich, die Differenzierung der wichtigsten neuronalen und glialen Zelltypen des Kleinhirns zu verfolgen, sowie Zellstadien und Subtypen zu identifizieren. So entstand eine umfassende Karte der zellulären Komplexität des Kleinhirns während der Entwicklung von Eutheriern (Mensch und Maus) und Beuteltieren (Opossum). Unter Ausnutzung des evolutionären Abstands von etwa 160 Millionen Jahren zwischen der Eutherier- und Beuteltierlinie konnten konservierte und divergierende Zelltyp-Markergene identifiziert werden, die vielversprechende Kandidaten für das Verständnis des grundlegenden Bauplans der Kleinhirn-Zelltypen sind. Durch Verfahren zur Angleichung der sehr unterschiedlichen Entwicklungszeiträume zwischen den drei untersuchten Spezies, konnte eine doppelte Abundanz an sich entwickelnden Purkinje Zellen im Menschen detektiert werden. Es wäre möglich, dass diese Beobachtung im Zusammenhang mit einem jüngst identifizierten Vorläuferpool an der ventrikulären Zone steht. Es konnte der Differenzierungsweg von Körner- und Purkinje-Zellen von frühen Vorläuferzellen zu reifen Neuronen modelliert werden. Es wurden konservierte und divergierende Genexpressionstrajektorien entdeckt. Mit Hilfe von in vitro und in vivo Intolleranzwerten konnte ich zeigen, dass Gene, die während der Differenzierung dynamisch exprimiert werden höheren funktionelle Einschränkungen aufweisen als nicht-dynamische Gene. Dies passt zu früheren RNA-seq-Studien, die ähnliche Ergebnisse bei der Entwicklung des gesamten Organs zeigten. Einige Orthologe mit divergierenden Mustern waren krankheitsassoziierte Gene, was Auswirkungen auf die klinische Forschung zu Krankheiten wie Autismus-Spektrum-Störungen und Medulloblastom haben könnte. Darüber hinaus wurden grundlegende Veränderungen der Genexpression, die als Zunahme oder Verlust der Expression innerhalb eines Zelltyps und einer Spezies definiert wurden, festgestellt. Betroffene Gene wiesen eine geringere funktionelle Einschränkung auf, was evolutionäre Prinzipien auf der Ebene der einzelnen Zelle bestätigen. Alles in allem, zeigt diese Studie die Stärke einer modernen Methodik in Kombination mit temporär hochauflösenden Probenschemata in einem evolutionsbiologischen Kontext, um grundlegende Prinzipien der Entwicklung eines Organs auf Einzelzellebene zu erforschen.