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Abstract

Histone deacetylase 10 (HDAC10) stands out among the eleven zinc-dependent hydrolases of the histone deacetylase family as the only polyamine deacetylase. It exhibits remarkable substrate specificity for N-acetylputrescine and N8 acetylspermidine over N1 acetylspermidine and shows no activity on acetyllysine residues. Although the role of selective polyamine deacetylation in health and disease is enigmatic, HDAC10 received little attention from medicinal chemists and no selective inhibitors suitable as chemical probes were available prior to this study. To address this deficiency, I developed the first well-characterized selective chemical probes for HDAC10 with unprecedented selectivity over other HDAC isozymes. The inhibitors were designed to imitate HDAC10’s polyamine substrates without also binding HDAC6, its closest relative. Insertion of an amino group into the hexyl linker moiety of the approved drug Vorinostat (SAHA) at the γ-position to the hydroxamic acid transformed SAHA from an unselective pan-inhibitor into a selective HDAC10 inhibitor. I further optimized the aza-SAHA scaffold in a medicinal chemistry campaign, which yielded DKFZ-748, a chemical probe for HDAC10 with a 22 nM IC50 against HDAC10 in cells and >500-fold selectivity over HDAC6, as well as Class I enzymes (HDAC1, 2, 3, 8). Selectivity and potency were validated by biochemical and cellular target engagement assays. Furthermore, cells treated with DKFZ-748 showed only accumulation of the polyamine substrates, but not hyperacetylation of HDAC6 or Class I substrates. Potency of the aza-SAHA derivatives could be rationalized with HDAC10 co-crystal structures and selectivity within the entire target landscape of HDAC drugs was demonstrated. Moreover, DKFZ-748 was successfully applied in a polyamine-limited in vitro tumor model, where it enabled HeLa cell growth inhibition, but showed no toxicity under other circumstances. With potent and selective HDAC10 binders at hand, I transitioned from occupancy-driven pharmacology of inhibitors to the event-driven pharmacology of targeted degraders that can remove HDAC10 in cells via induced proteasomal degradation, including potential scaffolding functions of the HDAC10 protein. I demonstrated targeted degradation of HDAC10 using pan-inhibitor-based compounds as a proof of principle, and established a solid-phase synthesis of aza-SAHA-based degraders. These are promising candidates for the selective degradation of HDAC10, based on the excellent selectivity profile of the aza-SAHA derivatives. Furthermore, in a separate approach, I investigated new scaffolds for selective HDAC10 inhibition based on a compound library screen. This part of the project aimed to develop selective HDAC10 inhibitors without the use of amino hydroxamic acids, which opens new therapeutic applications for HDAC10 inhibition beyond cancer therapy.

Translation of abstract (German)

Die Histondeacetylase 10 (HDAC10) sticht unter den elf zinkabhängigen Hydrolasen der Histondeacetylase-Familie als einzige Polyamin-Deacetylase hervor, die eine bemerkenswerte Substratspezifität für N-Acetylputrescin und N8-Acetylspermidin gegenüber dem N1-Acetylspermidin, sowie keine Aktivität für Acetyllysine in Proteinen, aufweist. Obwohl die Rolle der selektiven Polyamin-Deacetylierung in Physiologie und Pathophysiologie bisher ungeklärt ist, wurde HDAC10 von medizinischen Chemikern nur wenig untersucht, und zu Beginn der vorliegenden Arbeit waren keine selektiven Hemmstoffe verfügbar, die sich als chemische Sonden eignen. Um diese Lücke zu schließen, habe ich die ersten gut charakterisierten selektiven chemischen Sonden für HDAC10 entwickelt, die eine noch nie dagewesene Selektivität gegenüber anderen HDAC-Isoenzymen aufweisen. Die Hemmstoffe wurden so konzipiert, dass sie die HDAC10 Polyaminsubstrate imitieren, ohne auch HDAC6, ihren nächsten Verwandten, zu binden. Durch Einbau einer Aminogruppe in die Hexyl-Linkergruppe des zugelassenen Medikaments Vorinostat (SAHA) in der γ-Position zur Hydroxamsäure wurde SAHA von einem unselektiven Pan-Inhibitor zu einem selektiven HDAC10-Hemmstoff. Ich habe das Aza-SAHA-Gerüst durch systematische Derivatisierung weiter optimiert, was DKFZ-748 hervorbrachte, eine chemische Sonde für HDAC10 mit einer IC50 von 22 nM in Zellen und einer >500-fachen Selektivität gegenüber HDAC6 sowie Enzymen der HDAC Klasse I (HDAC1, 2, 3, 8). Selektivität und Wirksamkeit wurden durch biochemische und zelluläre Bindungsassays validiert. Darüber hinaus zeigten Zellen, die mit DKFZ-748 behandelt wurden, nur Akkumulation der Polyaminsubstrate, nicht aber Hyperacetylierung von HDAC6- oder Klasse-I-Substraten. Die Potenz der Aza-SAHA-Derivate konnte mit HDAC10-Kokristallstrukturen verstanden werden, und die Selektivität innerhalb der möglichen Wirkziele von HDAC-Hemmern wurde nachgewiesen. Darüber hinaus wurde DKFZ-748 erfolgreich in einem polyaminlimitierten In-vitro-Tumormodell eingesetzt, wo es ermöglichte das Wachstum von HeLa-Zellen zu hemmen, aber unter anderen Umständen keine Toxizität zeigte. Mit den potenten und selektiven HDAC10-Bindern als Grundlage wechselte ich von der bindegesteuerten Pharmakologie der Inhibitoren zur ereignisgesteuerten Pharmakologie des gezielten Proteinabbaus, womit sich HDAC10 in Zellen durch induzierten proteasomalen Abbau gezielt entfernen lässt. Dies schließt auch potenzielle Interaktionen des HDAC10-Proteins mit anderen Biomolekülen ein. Den gezielten Abbau von HDAC10 konnte ich mithilfe von Verbindungen auf der Basis von Pan-Inhibitoren nachweisen und ich habe zudem eine Festphasensynthese von Aza-SAHA-basierten Derivaten entwickelt. Diese sind aufgrund des hervorragenden Selektivitätsprofils der Aza-SAHA-Verbindungen vielversprechende Kandidaten für den spezifischen, ausschließlichen Abbau von HDAC10. Darüber hinaus untersuchte ich in einem separaten Ansatz neue Strukturmotive für die selektive Hemmung von HDAC10 auf der Grundlage eines Substanzbibliotheks-Screens. Dies zielte darauf ab, selektive HDAC10-Inhibitoren ohne den Einsatz von Aminohydroxamsäuren zu entwickeln, was neue therapeutische Anwendungen für die HDAC10-Hemmung über die Krebstherapie hinaus eröffnet.